婦炎凈片中氯化兩面針堿含量測定方法改進

廖玉群，康志華，付向紅，楊雷，熊家偉

江西藥都仁和制藥有限公司，江西 樟樹 331200

婦炎凈片處方由當歸、雞血藤、苦玄參、地膽草、菥蓂、五指毛桃、橫經席、兩面針、柿葉九味組成，具有清熱祛濕，調經止帶之功效，用于濕熱蘊結所致的帶下病、月經不調、痛經；慢性盆腔炎、附件炎、子宮內膜炎等證。方中兩面針具有祛風通絡，滲濕止痛，抗炎抗菌等活性［1］。本品為江西藥都仁和制藥有限公司擬進行二次開發的重點產品之一，現執行國家標準YBZ13472005-2009Z，標準中已有苦玄參、兩面針、地膽草、雞血藤的薄層鑒別，以及氯化兩面針堿的含量測定，其中氯化兩面針堿的含量規定每片中不得少于0.08 mg；而市場上秦皇島皇威制藥有限公司的同品種氯化兩面針堿的含量規定每片中不得少于0.22 mg（執行國家藥品標準YBZA12312006）。故在二次開發中，為進一步提高產品質量及質量的可控性，對本品中氯化兩面針堿的含量及其測定方法進行了研究，對原標準含量測定方法進行了改進，改進后的方法操作簡便，重復性良好，結果準確，具有專屬性；同時提高了氯化兩面針堿的內控含量指標，由原標準中每片不少于0.08 mg，提高為每片不少于0.20 mg。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀：島津LC-20AD、安捷侖1260 Ⅱ；電子天平：CP224S 賽多利斯（d=0.1 mg）及CP225D（d=0.01 mg、0.1 mg）。

1.2 試藥

氯化兩面針堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110848-201802，含量以91.0%計，使用前不需干燥處理）；婦炎凈片樣品（由江西藥都仁和制藥有限責任公司提供，批號：191001、191002、191003、200301、200302、200303、200801、200802、200901、210301）；

乙腈為色譜純（購自美國天地公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 原注冊標準方法

2.1.1 色譜條件與系統適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水-三乙胺（23∶77∶0.3）（用磷酸調pH 值為3.0）為流動相；檢測波長為328 nm。理論板數按氯化兩面針堿峰計算應不低于2 000。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取氯化兩面針堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含5 μg 的溶液，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取重量差異項下的樣品，研細，取約2.0 g，精密稱定，精密加入1%鹽酸甲醇溶液50 mL，穩定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用1%鹽酸甲醇溶液補足重量，濾過，精密吸取續濾液10 mL，過中性氧化鋁柱（100-200目，10 g，內徑1.5 cm），用甲醇50 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

在大量的生產實踐中發現，本法重現性不理想，影響因素較多，結果偏差較大，加樣回收率偏低，不能真實反映出氯化兩面針堿的含量。

2.2 改進后的方法

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗［2-7］以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈：0.02 mol/L KH2PO4（22∶78）；檢測波長為328 nm。理論板數按氯化兩面針堿峰計算應不低于2 000。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取氯化兩面針堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含10 μg 的溶液，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備［8-9］取重量差異項下的樣品，研細，取約1.0 g，精密稱定，精密加入1%鹽酸甲醇溶液50 mL，穩定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用1%鹽酸甲醇溶液補足重量，濾過，精密吸取續濾液25 mL，蒸干，殘渣加水20 mL 使溶解，用稀鹽酸調pH 1～2 后，用三氯甲烷振搖提取3 次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣用甲醇使溶解，定量轉移至25 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.2.5 分析方法確認 按照《中國藥典》2020 年版四部通則9101 藥品質量標準分析方法驗證指導原則，選取線性關系、專屬性、定量限、回收率、精密度、耐用性、穩定性作為確認指標，對改進后的分析方法進行了確認，結果如下。

線性關系考察：以氯化兩面針堿的濃度（μg/mL）為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y，繪制標準曲線，得回歸方程Y=46.869X-2.162，相關系數r=0.999 9（n=6）。氯化兩面針堿質量濃度在2.06～51.50 μg/ mL范圍內與峰面積線性良好。

專屬性試驗：色譜圖中，氯化兩面針堿能夠較好地分離，保留時間適中，陰性無干擾，專屬性好。

精密度試驗：取氯化兩面針堿對照品溶液（濃度為20.60 μg/ mL），連續進樣6 次，測定峰面積，結果的RSD 為0.66%（n=6），小于2%，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：按供試品溶液制備方法制成供試品溶液（批號191001），同時取氯化兩面針堿對照品溶液（20.60 μg/ mL），分別在放置0、2、4、6、8、10、12、24 h 進樣，測定峰面積，結果的RSD 為1.3%（n=8），表明溶液在24 h 內穩定性良好。

重復性試驗：取樣品（批號191001）6 份，按正文中含量測定項下方法試驗，測定氯化兩面針堿的含量，結果6 份樣品所測得氯化兩面針堿平均含量為289.22 μg/片，RSD 為1.6%（n=6），表明方法重復性良好。

定量限：當信噪比為10∶1 時，氯化兩面針堿的濃度為20 ng/mL。

圖1 高效液相色譜圖：A.陰性樣品；B.供試品；C.對照品

2.3 原注冊標準方法及改進后的方法對比

取樣品（批號191001），分別采用原注冊標準方法及改進后的方法，進行精密度、加樣回收率以及耐用性試驗，測定氯化兩面針堿的含量，檢測結果匯總見表1～3。

表1 精密度試驗結果對比（μg/片）

表2 加樣回收率試驗結果對比（%）

表3 耐用性試驗結果對比（μg/片）

結果，原注冊標準方法精密度、加樣回收試驗及耐用性試驗的RSD 分別為1.9%、3.3%和1.9%，改進后方法的精密度、加樣回收試驗及耐用性試驗的RSD 分別為0.4%、0.7%和0.3%，表明改進后的方法較原方法的精密度、準確度及重現性更理想，原方法加樣回收率偏低，改進后的方法平均加樣回收率為99.5%，表明結果準確，更能真實地反應出本品中氯化兩面針堿的含量，可用于本品的質量控制。

3 樣品測定

取本品，分別按原方法及改進后的方法測定氯化兩面針堿的含量，改進后的方法檢測的氯化兩面針堿的含量均比原方法檢測結果高；考慮到不同產地的兩面針中氯化兩面針堿的含量有高有低［10］，擬將氯化兩面針堿的含量由每片不得少于0.08 mg，提高至每片不得少于0.20 mg。檢測結果見表4。

表4 10批樣品中氯化兩面針堿的含量（μg/ 片）

4 討論

4.1 流動相的選擇

氯化兩面針堿屬苯駢菲喧類生物堿，其結構中堿性氮原子與固定相未鍵臺酸性硅醇基的相互作用，使得色譜峰的展寬拖尾，峰漂移及峰對稱性差，導致分離效能低。故對比了在流動相中加添加緩沖鹽及有機胺改性劑的效果，結果乙腈-0.02 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（22∶78）的效果優于乙腈-水-三乙胺（23∶77∶0.3）（用磷酸調pH 值為3.0），況且三乙胺對色譜柱的損害不易逆轉，故選擇采用乙腈-0.02 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（22∶78）為流動相。

4.2 檢測波長的選擇

氯化兩面針堿對照品溶液及供試品溶液在271 nm及328 nm 處均有吸收峰，在328 nm 下的色譜圖中雜質干擾峰稍少，故仍選取328 nm 作為檢測波長，不做修訂。

4.3 供試品溶液的制備

修訂的方法采用1%的鹽酸酸化的甲醇進行回流提取，可以使游離的兩面針堿結合成為無機酸鹽，從而能夠提高氯化兩面針堿的提取率；但同時使得提出的雜質也增多；大多數游離生物堿都是親脂性的，故甲醇液蒸干后，加水使溶解調pH1～2,再用三氯甲烷萃取，以達到分離純化的目的。原方法中采用通過中性氧化鋁柱進行分離純化，結果，在去除雜質的同時，將目標成分氯化兩面針堿同時損失了一部分，造成檢測結果比真實含量偏低，結果不準確。

試驗中，對各試驗條件進行了優化篩選，如不同提取溶劑、回流提取時間、萃取次數、流動相比例等，結果以正文條件為佳。所建立的方法操作簡便，專屬性強，重復性理想，結果準確，優于原方法，能真實地反應本品中氯化兩面針堿的含量。可用于婦炎凈片的質量控制。