高效液相色譜法同時測定姜天麻飲片中天麻素和對羥基苯甲醇含量

唐慶，楊德泉，佘永紅

湘西土家族苗族自治州食品藥品檢驗所，湖南 吉首 416000

天麻為蘭科植物天麻的干燥塊莖［1］。生品味甘，性平。歸肝經(jīng)。功能與主治為：息風(fēng)止痙、平抑肝陽、祛風(fēng)通絡(luò)。用于小兒驚風(fēng)，癲癇抽搐，破傷風(fēng)，頭痛眩暈，手足不遂，肢體麻木，風(fēng)濕痹痛。天麻化學(xué)成分主要有酚類、有機酸類及植物中常見的甾醇類，其有效成分為天麻素、對羥基苯甲醇等酚類成分［2-3］。天麻素又名天麻苷，是天麻塊莖中一種含量最高的有效單體成分，其化學(xué)名為4-羥甲基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，在結(jié)構(gòu)上由4-羥基苯甲醇和葡萄糖兩種單體組成，經(jīng)苦杏仁酶水解后得到對羥基苯甲醇和葡萄糖兩種單體［4］。現(xiàn)代藥理學(xué)顯示二者在失眠、驚厥、抑郁、缺血性腦卒中、焦慮、認知障礙等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面有顯著療效，并且發(fā)現(xiàn)該類疾病與神經(jīng)遞質(zhì)、細胞因子等密切相關(guān)［5］，天麻中對羥基苯甲醇在體內(nèi)、體外均具有顯著的抗血小板聚集活性［6］。姜天麻為凈天麻片經(jīng)姜制的飲片，炮制目的是增強天麻止痛、抗眩暈之效［7］。張霞等［8］研究探討了姜天麻炮制前后對硝酸甘油誘導(dǎo)的大鼠偏頭痛的影響，認為天麻對硝酸甘油誘導(dǎo)的大鼠偏頭痛作用，可能是通過降低一氧化氮（NO）、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）和提高血漿內(nèi)皮素（ET）、多巴胺（DA）、5-羥色胺（5-HT）的含量，以改善偏頭痛癥狀，且姜天麻較生品作用強，說明炮制后藥效增強。陸平等［7］用HPLC法，以天麻素為含量指標，比較了姜天麻、生天麻、硫黃熏蒸天麻的含量，結(jié)果姜天麻中的天麻素含量相對較高，認為可能是天麻在姜制過程中，使得姜汁中的某些易溶出的成分加速了天麻素的溶出，提高了天麻素的溶出率。天麻質(zhì)量評價的研究中，大多僅局限于天麻素的單成分分析，在對中藥進行質(zhì)量評價時，選擇單一成分不能夠全面反應(yīng)中藥質(zhì)量。酚類化合物是天麻主要活性成分，天麻素和對羥基苯甲醇是天麻藥材及含天麻中成藥質(zhì)量評價的指標成分［9］。姜天麻是《湖南省中藥飲片炮制規(guī)范（2010年版）》［10］收載飲片品種。該標準中含量測定方法為HPLC 法測定天麻素的含量，為使姜天麻飲片質(zhì)量得到更有效地控制，筆者用高效液相法，進行了姜天麻飲片中的天麻素和對羥基苯甲醇兩種成分含量測定方法研究，建立了姜天麻的天麻素和對羥基苯甲醇的含量測定方法，為定量控制姜天麻質(zhì)量提供了有效手段，現(xiàn)報告如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT 島津高效液相色譜儀；檢測器：SPDM20A；色譜柱：日本株式會社YMC HPLC Column C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，型號：HS12S05-2546WT）；電子天平：METTLER TOLEDO（型號AB135-S，十萬分之一）；超聲波清洗器（型號：KQ-200B，功率300 W，40 KHz）。

1.2 試藥

姜天麻飲片5 批（湖南博世康中醫(yī)藥有限公司，批號201 911025；湖南然潤堂中藥有限公司，批號2019 112203；湖南衡岳中藥飲片有限公司，批號19111228-1；湖南振興中藥有限公司，批號19112525-1；湖南三湘中藥飲片有限公司2020060106）；天麻素對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量測定用，批號：110807-202010，含量以95.5%計）；對羥基苯甲醇對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量測定用，批號111970-201702，含量以99.4%計）。乙腈為色譜純（批號2103542），水為超純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相色譜條件

色譜柱：YMC HPLC Column C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97）；流速：0.8 mL/min；檢測波長為220 nm；柱溫35 ℃。理論板數(shù)按天麻素峰計算，不低于5 000。進樣量為5 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液 取天麻素對照品、對羥基苯甲醇對照品各適量，精密稱定，加乙腈-水（3∶97）混合溶液分別制成含天麻素196.539 μg/mL、對羥基苯甲醇512.407 μg/mL 對照品儲備液。精密吸取天麻素對照品儲備液（196.539 μg/mL）5 mL 及對羥基苯甲醇對照品儲備液（512.407 μg/mL）1 mL 同置20 mL 容量瓶中，加乙腈-水（3∶97）混合溶液稀釋至刻度，搖勻，即得含天麻素49.135 μg/mL、對羥基苯甲醇25.620 μg/mL 混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品粉末（過三號篩）約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，濾過，精密量取濾液10 mL，濃縮至近干無醇味，殘渣加乙腈-水（3:97）混合溶液溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL 量瓶中，用乙腈-水（3∶97）混合溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取混合對照品溶液、供試品溶液按上述色譜條件進樣，記錄色譜圖，見下圖1、圖2。結(jié)果表明，混合對照溶液中天麻素與對羥基苯甲醇保留時間分別為13.795 min、23.536 min，樣品中天麻素與對羥基苯甲醇保留時間分別為13.828 min、23.323 min,樣品中其他成分對天麻素、對羥基苯甲醇的測定無干擾。樣品中理論板數(shù)按天麻素峰計算為23 839，不低于5 000；樣品中天麻素與前面的雜質(zhì)峰分離度為2.373，對羥基苯甲醇與天麻素分離度為7.871，均大于1.5；天麻素與對羥基苯甲醇拖尾因子分別為1.04、0.97，均在0.95～1.05 之間；重復(fù)性實驗：取混合對照品溶液，連續(xù)進樣5 次，記錄色譜峰面積，天麻素RSD=0.09%（n=5），對羥基苯甲醇RSD=0.22%（n=5），均不大于2.0%；說明系統(tǒng)適用性符合要求。

圖1 天麻素、對羥基苯甲醇混合對照溶液HPLC色譜圖

圖2 供試品溶液HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取天麻素對照品、對羥基苯甲醇對照品各適量，加乙腈-水（3:97）混合溶液分別制成天麻素對照品儲備液（380.854 μg/mL）及對羥基苯甲醇對照品儲備液（179.715 μg/mL）。

精密吸取天麻素對照品儲備液，對羥基苯甲醇對照品儲備液各適量加乙腈-水（3∶97）混合溶液依次稀釋成為含天麻素濃度為152.341 6、114.256 2、76.170 8、47.606 8、23.803 4、9.521 4、0.952 1 μg/mL及含對羥基苯甲醇濃度為71.886 0、53.914 5、35.943 0、22.464 4、11.232 2、4.492 9、0.449 3 μg/mL 的混合對照品溶液。精密吸取上述系列混合對照品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測定，以峰面積積分值為縱坐標，濃度為（μg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線。天麻素回歸方程為y=111 535x-643.18，r=0.999 9；對羥基苯甲醇回歸方程為y=20 768x-3 212.7，r=0.999 9；結(jié)果表明天麻素和對羥基苯甲醇對照品分別在0.952 1～152.341 6 μg/mL 和0.449 3～71.886 0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗

取同一姜天麻供試品溶液（湖南然潤堂中藥有限公司，批號2019102203），連續(xù)進樣6 次，每次5 μL，記錄色譜峰面積，計算天麻素RSD=1.37%（n=6），對羥基苯甲醇RSD=0.86%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一姜天麻供試品溶液（批號2019102203），分別于配制后的0、3、6、12、24 h，精密吸取5 μL，注入液相色譜儀，測定，結(jié)果：天麻素的RSD=1.06%，對羥基苯甲醇的RSD=1.52%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一姜天麻供試品溶液（批號2019102203），依“2.2.2”項方法制備6 份供試品溶液，測定并按干燥品計算，結(jié)果：天麻素的含量平均值為0.30%，RSD 為0.67%；對羥基苯甲醇的含量平均值為0.09%，RSD 為2.35%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 耐用性試驗

分別用液相色譜儀（1）LC-20AT，色譜柱YMC C18（250mm×4.6mm×5 μm，編號HS12S05-2546WT，YMC 公司）和（2）Agilent 1260Ⅱ，色譜 柱Agilent C18（250mm ×4.6mm×5 μm，編 號588905-902，Agilent 公司），平行測定同一批號的3 份樣品，結(jié)果3 份樣品天麻素含量分別為：（1）0.30%、0.30%、0.30%；（2）0.29%、0.29%、0.29%。（1）與（2）測定的3 份含量結(jié)果之間的RSD 均為2.40%；對羥基苯甲醇含量分別為：（1）0.087%、0.087%、0.084%；（2）0.087%、0.085%、0.087%。（1）與（2）測定的3 份含量結(jié)果之間的RSD 分別為0%、1.64%、2.48%結(jié)果表明：本方法耐用性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已測定含量的同一姜天麻供試品溶液（批號2019102203，含水分10.12%，按干燥品計算含天麻素0.304 3%、對羥基苯甲醇0.086 %）約1 g（9 份），精密稱定，置具塞錐形瓶中，按含量的80%、100%和120%左右的水平精密加入濃度為1 896.152 5 μg/mL 的天麻素對照品及濃度為1 015.868 5 μg/mL 對羥基苯甲醇對照品適量（所用量具為經(jīng)校正的刻度吸管），見表1、表2，依“2.2.2”項方法制備供試品溶液，測定，計算含量。結(jié)果天麻素及對羥基苯甲醇平均加樣回收率分別為99.18%、95.21%。RSD 分別為2.65%（n=9）、2.75%（n=9）表明本方法加樣回收率良好。

表1 天麻素加樣回收率試驗結(jié)果表

表2 對羥基苯甲醇加樣回收率試驗結(jié)果表

2.10 樣品含量測定

取姜天麻飲片5 批（批號：201911025、2019112203、19111228-1、19112525-1、2020060106），按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，進行測定，分別按外標兩點法計算天麻素和對羥基苯甲醇的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

采用HPLC 法或UPLC 法分析天麻和天麻飲片中成分的含量，研究報道較多，分析檢測天麻中的成分有天麻素、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E、對羥基苯甲醇、原兒茶酸等［11-15］。在采用HPLC 法測定姜天麻中的主要成分含量的研究方面，報道較少［7］。《中國藥典》2020 年版一部［1］天麻的標準中，天麻的含量測定成分為天麻素和對羥基苯甲醇。因此，本方法以姜天麻中的天麻素和對羥基苯甲醇作為含量測定成分。本實驗建立的測定姜天麻飲片中的天麻素和對羥基苯甲醇含量的方法，快速，準確，高效，靈敏，為姜天麻的質(zhì)量控制提供了有效的檢測手段。