高效液相色譜法測定復方尿囊素乳膏中尿囊素的含量

丁志軍，李小蘭，付志媛

江西省皮膚病專科醫院，江西 南昌 330001

復方尿囊素乳膏是江西省皮膚病專科醫院外用乳膏制劑，主要由尿囊素、維生素E、二甲硅油、羥苯乙酯及基質組成。臨床上主要用于皮膚干燥皸裂、皮膚瘙癢、鱗屑性皮膚病，療效顯著。尿囊素能增加皮膚角質層細胞粒合質的吸濕能力，并直接作用于角質蛋白分子，促進其吸收水分，使皮膚光滑柔軟。制劑原標準對尿囊素含量測定采用紫外分光光度法［1-2］，專屬性不強，其測定操作過程復雜、過濾困難，影響測定重復性。為了更好的控制制劑質量，保證制劑療效，采用高效液相色譜法（HPLC）測定復方尿囊素乳膏中尿囊素的含量。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1260 高效液相色譜儀（美國），BT-125D Sartorius型電子天平；島津UV-1800型紫外分光光度計。

1.2 試藥

尿囊素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111501-200202）；磷酸二氫鈉（廣東光華科技股份有限公司，批號：20190829）；磷酸氫二鈉（廣東光華科技股份有限公司，批號：20190829）；復方尿囊素乳膏（江西省皮膚病專科醫院，批號：210301、210302、210303），蒸餾水（自制）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鈉0.87 g、磷酸氫二鈉1.35 g，加水使溶解成1 000 mL）；檢測波長為210 nm；流速為0.4 mL/min；柱溫：20 ℃。理論塔板數按尿囊素峰計應不低于8 000。主成分峰與相鄰雜質峰的分離度應大于1.5。

2.2 對照品溶液的制備

取尿囊素對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL 含13.2 μg 的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品約0.45 g，精密稱定，置100 mL 量瓶中，加水適量，置于65 ℃水浴中加熱約10 min，振搖使尿囊素溶解，放涼至室溫后，用水稀釋至刻度，搖勻，置冰浴中冷卻2 h 以上，取出，迅速過濾，濾液放至室溫，備用。

2.4 陰性對照溶液的制備

稱取按復方尿囊素乳膏處方工藝方法制備的不含尿囊素的陰性樣品適量，按“2.3”項下方法制備。

2.5 專屬性試驗

按上述色譜條件，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果，供試品在與對照品色譜圖相應的位置上有相同的尿囊素峰，而陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖：A.溶劑；B.陰性對照溶液；C.對照品溶液；D.樣品溶液

2.6 線性關系考察

精密稱取尿囊素對照品16.07 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 mL，置25 mL 量瓶中，以水稀釋至刻度，搖勻，分別取10 μL 注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標，進樣量（μg）為橫坐標，進行線性回歸，尿囊素的回歸方程為：Y=2 503.415 6X+4.802 4（r=0.999 95），線性范圍為0.064 28～0.642 80 μg。

2.7 檢出限

取尿囊素對照品適量，用水溶解并逐級稀釋后測定，尿囊素的檢出限為0.117 ng。

2.8 精密度試驗

取對照品溶液，注入液相色譜儀，連續進樣6次，每次10 μL，測得尿囊素平均峰面積值，RSD為0.18%，表明儀器精密度良好。

2.9 穩定性試驗

精密吸取對照品溶液，室溫條件下連續進樣3 d，測得尿囊素平均峰面積值，結果顯示尿囊素有降解現象，配制后8 h 內RSD 為0.68%（n=5），24 h 內RSD 為2.27%，48 h 內RSD 為4.33%，72 h 內RSD為15.44%，建議對照品溶液在配制后8 h 內使用。

將新配制的對照品溶液用環己烷液封于冰箱（5 ℃）中放置保存，室溫條件下連續15 d 測定，測得其RSD 為1.13%，結果顯示，尿囊素對照品水溶液在5 ℃至少可穩定15 d。

2.10 重復性試驗

取同一批樣品6 份，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定，進樣量為10 μL，測得峰面積值，計算尿囊素含量，RSD 分別為0.19%，表明此法重復性良好。

2.11 加樣回收率試驗

取同一批已知含量的樣品（批號210301）7 份，分別精密加入尿囊素對照品溶液（精密稱取尿囊素對照品16.39 mg，置25 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得）1 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定，進樣量為10 μL。結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n=7）

2.12 樣品含量測定

取本品3批，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定，進樣量為10 μL，按外標法計算復方尿囊素乳膏中尿囊素標示量的百分含量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n=3）

3 討論

3.1 檢測波長的確定

參考文獻［3-4］，尿囊素的檢測波長有210、217、224 nm，同時考慮到磷酸鹽緩沖液的截止波長為200 nm，結合尿囊素對照品水溶液紫外分光光度計在190～400 nm 波長范圍內掃描結果，最終選擇210 nm 為尿囊素的測定波長。

3.2 流動相的選擇

參考文獻［5-15］的方法，選擇甲醇-水（5 ∶95）、甲醇-0.1%磷酸溶液（5 ∶95）、0.01 mol/L 磷酸二氫鉀溶液、水等作為流動相。經摸索，結果以磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鈉0.87 g、磷酸氫二鈉1.35 g，加水使溶解成1 000 mL）為流動相跑出的基線平坦、峰形對稱，分離效果最好，故選其作為流動相。

3.3 色譜柱的選擇

本試驗曾采用普通C18 柱進行測定，結果尿囊素在幾分鐘內就出峰，與溶劑峰分不開，為進一步延長尿囊素的出峰時間，需降低流動相中有機相甲醇的比例，采用純水為流動相的SB Aq 色譜柱，能使尿囊素峰分離且基線穩定。也曾考察過氨基柱，但跑出的色譜圖基線不平，影響尿囊素峰積分的準確性，同時氨基柱的使用壽命短。因此，采用Agilent ZORBAX SB-Aq 為本試驗的色譜柱。

3.4 溶媒的選擇

尿囊素在熱水、氯化鈉試液中溶解，在乙醇中不溶，因此，先后選擇用純化水以及流動相為提取溶劑進行了考察，結果采用純化水、流動相作為樣品處理的提取溶劑均能將尿囊素提取完全。考慮到鹽對色譜柱的影響，最終選擇水為提取溶劑。另外，對提取溫度、提取時間進行了單因素試驗考察，結果水浴溫度為65 ℃、提取時間10 min 時含量最高，故選擇65 ℃水浴加熱提取10 min。

綜上所述，利用HPLC 法檢測復方尿囊素乳膏中尿囊素含量快速、簡便、準確、靈敏度高，該方法能有效控制復方尿囊素乳膏的含量。