不同部位來源的耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌檢出情況及耐藥性分析

張鴻娟，單 斌，孟雪斐，宋貴波，蘇艷丹*

(1 昆明醫科大學第一附屬醫院醫學檢驗科，昆明 650032；2 云南省醫學檢驗臨床研究中心，昆明 650032；3 昆明醫科大學第一附屬醫院臨床檢驗診斷省創新團隊，昆明 650032)

細菌耐藥已嚴重威脅全球公共健康領域，其中耐碳青霉烯類腸桿菌目細菌(carbapenem-resistant Enterobacterales，CRE)引起的感染形勢最為嚴峻。美國疾病預防控制中心對CRE的定義[1]：滿足以下任意一個條件的腸桿菌目細菌即定義為CRE。① 對亞胺培南、美羅培南、厄他培南或多利培南任何一種碳青霉烯類抗菌藥物耐藥者。天然對亞胺培南敏感性低的細菌(如摩根菌屬、變形桿菌屬和普羅威登菌屬等)，需參考除亞胺培南外的其他碳青霉烯類抗菌藥物的藥敏結果。② 產生碳青霉烯酶。不同國家、地區、醫院、人群以及細菌所產的碳青霉烯酶種類均有差異[2-3]。本研究對不同部位來源的CRE進行分類統計，探討不同部位來源的CRE檢出情況及耐藥性，供臨床參考。

1 材料與方法

1.1 細菌來源

菌株來源于2018～2020年本院門診和住院患者送檢的各部位樣本，經臨床微生物室進行分離、培養，藥敏結果顯示對任何一種碳青霉烯類抗菌藥物不敏感，摩根菌屬、變形桿菌屬對亞胺培南以外的其他碳青霉烯類抗菌藥物亦不敏感，剔除同一患者相同部位的重復菌株后納入分析。按照不同部位來源[腦脊液、血液、體液(胸水、腹水、關節腔積液等)、尿液、痰液、其他(引流液、膿液、膿腫等)]進行分類統計。

1.2 藥敏試驗

試驗方法包括紙片擴散法、自動化儀器法和 E-test 法等，結果判讀參考當年美國臨床實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標準。藥敏結果為敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)，中介結果不展示。

1.3 數據分析

采用WHONET 5.6和SPSS 22.0分析處理結果，比較采用R×C表卡方檢驗，P<0.05表示有統計學差異。

1.4 質控菌株

質控菌株采用大腸埃希菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、表皮葡萄球菌ATCC 49134、肺炎克雷伯菌ATCC700603、陰溝腸桿菌ATCC700323、銅綠假單胞菌ATCC 27853、肺炎鏈球菌ATCC 49619、糞腸球菌ATCC 29212、屎腸球菌ATCC 35667，每周進行一次質控。

2 結果

2.1 菌株分布

2.1.1總體分布

2018～2020年共檢出腸桿菌目細菌11 389株，2018年3492株、2019年3982株、2020年3915株。檢出CRE 1690株，2018年657株、2019年555株、2020年478株。檢出的CRE占腸桿菌目細菌的比例為2018年18.81%、2019年13.94%、2020年12.21%。CRE占腸桿菌目細菌的比例呈逐年下降趨勢。

2.1.2菌株的構成

2018～2020年CRE菌株排名前3位的均是肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌，共檢出肺炎克雷伯菌1452株(占85.92%)、大腸埃希菌94株(占5.56%)、陰溝腸桿菌56株(占3.31%)，黏質沙雷菌、弗氏檸檬酸桿菌等偶有檢出。CRE的菌株構成見表1。

表1 2018～2020年CRE的構成情況

2.1.3不同部位來源的CRE檢出情況

不同部位來源的腸桿菌目細菌的檢出排名前3位的均是肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌。其中，陰溝腸桿菌排名均為第3位，肺炎克雷伯菌與大腸埃希菌標本來源不同排名有差異。尿液中分離出的大腸埃希菌最多，與其他部位分離的大腸埃希菌相比具有統計學差異(χ2=123.921，P=0.0001)。不同部位來源的腸桿菌目細菌檢出情況見表2。不同部位來源的腸桿菌目細菌中CRE的占比不同。其中，腦脊液中CRE的占比最高，連續3年均超過30%，且呈增長趨勢；尿液標本中CRE的占比最低，低于10%。不同部位來源的CRE占腸桿菌目細菌中的比例具有統計學差異(χ2=561.5646，P=0.0001)。見表3。

表2 不同部位來源的腸桿菌目細菌檢出情況

表3 不同部位來源的腸桿菌目細菌中CRE檢出情況

2.2 藥敏情況

2.2.1碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌藥敏情況

2018～2020年分離出碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌共1452株。碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率均>95%，除對阿米卡星、復方新諾明、磷霉素、四環素部分敏感外，對其他的抗菌藥物幾乎全部耐藥。其中，不同部位來源分離的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌對復方新諾明的耐藥率比較無統計學差異(χ2=9.8849，P=0.4506)；對阿米卡星(χ2=34.5387，P=0.0001)、磷霉素(χ2=37.62，P=0.0001)、四環素(χ2=79.559，P=0.0001)的耐藥率比較有統計學差異。未發現對替加環素耐藥的菌株。見表4。

表4 碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌藥敏情況 %

2.2.2碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌藥敏情況

2018～2020年分離出碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌共94株。其中，腦脊液中未分離出碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌；尿液中分離出的最多，為22株。碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率≥50.0%。痰液中分離出的大腸埃希菌耐藥率最高，為91.7%；尿液中分離出的耐藥率最低，為50.0%。對復方新諾明、慶大霉素、阿米卡星、磷霉素部分敏感，不同部位來源分離出的菌株對復方新諾明(χ2=41.3338，P=0.0001)、阿米卡星(χ2=26.5861，P=0.0008)、磷霉素(χ2=30.9682，P=0.0001)耐藥率比較有統計學差異，對慶大霉素(χ2=10.813，P=0.2125)耐藥率比較無統計學差異。未發現對替加環素耐藥的菌株。見表5。

表5 碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌藥敏情況 %

2.2.3碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌藥敏情況

2018～2020年分離出碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌56株。其中，腦脊液中未分離出碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌，血液中分離出1株、體液中分離出2株。血液中分離出的碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌除對替加環素敏感外，對其他抗菌藥物全部耐藥。體液中分離出的碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌除對替加環素敏感外，1株對復方新諾明敏感，對其他抗菌藥物全部耐藥。尿液、痰液、其他部位分離出的碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率為25%～75%。其中，痰液中分離出的耐藥率最低，尿液中分離出的耐藥率最高，對慶大霉素、阿米卡星、磷霉素、妥布霉素有一定的敏感率。未發現對替加環素耐藥的菌株。見表6。

表6 碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌藥敏情況 %

3 討論

碳青霉烯類抗菌藥物被認為是抗產超廣譜β內酰胺酶菌株的最后一道防線[4]。近年來，隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛使用，腸桿菌目細菌對其耐藥率呈快速增長趨勢。CHINET中國細菌耐藥監測網顯示，我國臨床分離肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率從2005年的3%快速攀升至2019年的25%以上，上升幅度高達8倍[5]。臨床分離出的CRE對抗菌藥物呈廣泛耐藥甚至全耐藥的特征[6]，可以選擇的抗菌藥物有限，死亡率高。研究顯示[7-8]，CRE所致侵襲性感染(如血流感染)的死亡率可達40%～50%，甚至更高。早期合理使用抗菌藥物能有效降低CRE感染導致的死亡率[9]。本研究對本院臨床微生物室2018～2020年分離出的CRE按感染途徑進行統計分析。結果顯示，2018～2020年CRE中排名前3位的都是肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌，其中肺炎克雷伯菌與大腸埃希菌占比達90%以上，與CHINET中國細菌耐藥監測網的結果一致[10-11]。隨著臨床對CRE認識的進一步提升，尤其是《遏制細菌耐藥國家行動計劃(2016—2020年)》推廣后，在多部門的共同努力下，2018～2020年醫院CRE的檢出株數及CRE在腸桿菌目細菌中的占比持續下降。

主動篩查在CRE的防控中具有重要意義。本研究中，不同部位來源檢出的CRE數量不同，CRE占同類標本中腸桿菌目細菌比例不同。其中，痰液中檢出的CRE數量最多，腦脊液檢出的腸桿菌目細菌中CRE占比最高，尿液中檢出的CRE占比最低。腦脊液中檢出的CRE高，與全國數據一致[12]。這可能與中樞神經系統的解剖結構相關，腦脊液中檢出的全部是碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌。痰液在臨床分離細菌的標本來源中排名第一[10,13]，痰液中有大量的細菌定植。CRE定植導致CRE感染率高達16.5%[13-14]。本研究中，所有腦脊液中檢出CRE，同時段的痰液中均檢出CRE，是否為同一菌株，還需要進一步分析。尿液中分離出腸桿菌目細菌中大腸埃希菌占比為76.55%，高于其他標本，而碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌的比例較低。因此，尿液中CRE的占比最低。主動篩查能及時發現定植患者，有助于及時采取感染防控措施，預防耐藥菌的院內傳播，降低患者死亡率[15-17]，有條件的醫院應根據本院CRE情況開展主動篩查。

不同細菌對抗菌藥物的耐藥率不同，CRE菌株除對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥外，對其他抗菌藥物呈廣泛耐藥，僅對阿米卡星、復方新諾明、磷霉素、四環素部分敏感。碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率低于碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌；對復方新諾明、慶大霉素、阿米卡星、磷霉素部分敏感，對同類藥物的耐藥率低于碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌。在不同部位來源的腸桿菌目細菌的檢出中，碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌均為第3名，占比約為3%，有上升的趨勢。目前對碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌的研究較少，但是有研究表明[18]，碳青霉烯類耐藥陰溝腸桿菌雖然為低毒細菌，但其耐藥模式、耐藥基因、多位點序列分型呈現異質性，應采取有效的感染預防措施，減少碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌的傳播。

傳統臨床微生物室的工作模式為細菌的鑒定和藥敏試驗同步進行，2種結果反饋給臨床的時間間隔不長。近年來，隨著基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)、分子生物學技術、宏基因組學第二代測序(以下簡稱二代測序)等技術的快速發展，微生物的鑒定速度快速提升。常悅等[19]通過多重聚合酶鏈式反應(PCR)與MALDI-TOF MS聯用，建立了一套可以快速、準確地鑒定引起血流感染的7種常見病原菌檢測方法。該方法不僅可以縮短細菌的鑒定時間，還可檢測多重細菌混合感染，彌補混合感染漏檢可能。使用Xpert Carba-R Assay檢測系統可以在呼吸道感染時，直接對痰液中的CRE耐藥基因進行鑒定[20]。使用MALDI-TOF MS技術對尿路感染的致病菌進行診斷[21]。二代測序可以檢測到其他傳統方法無法檢測到的病原體[22]。從傳統培養轉向分子生物學診斷，不僅對臨床微生物室是一個挑戰，對臨床抗感染治療也是挑戰，臨床經驗用藥顯得尤為重要。中樞神經系統感染具有起病急、病程長、難治愈、死亡率高等特點。其中，醫院獲得性感染患者腦脊液分離常見病原菌是革蘭陰性桿菌[22]。本研究中，腦脊液中腸桿菌目細菌均為肺炎克雷伯菌，其中碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌占比高于30%。采用傳統的腦脊液培養方法陽性率較低，一般低于40%[23-24]。因此，對于腦脊液培養結果為陰性，但是二代測序等方法檢出肺炎克雷伯菌時，應進行CRE感染高危因素評估[25]。如果存在長期住院、入住重癥加強護理病房(ICU)、碳青霉烯類抗菌藥物暴露史等危險因素時，應盡早開始CRE經驗性治療。

CRE菌株表現為多重耐藥，本研究中未發現對替加環素耐藥的菌株。替加環素是甘氨酰環素類抗菌藥物，是半合成四環素米諾環素的衍生物，可通過抑制細菌蛋白質合成而發揮抗菌作用[26-28]。CRE感染的有限治療，使一些藥物再次應用于臨床一線，如多黏菌素成為治療CRE感染的重要治療藥物[29]。此外，新的抗生素及其復合制劑也不斷被開發并應用于臨床，如頭孢他啶/阿維巴坦是一種新型頭孢菌素與β內酰胺酶抑制劑的復合制劑，2019年5月在我國上市。該藥對產絲氨酸碳青霉烯酶菌株具有高度抗菌活性，作為一種新藥廣泛應用于臨床[30-31]。實驗室對多黏菌素藥敏試驗開展較晚，藥敏數據較少，未進行統計分析，但是作為針對CRE的最后防線，有條件的實驗室應盡快開展多黏菌素藥敏試驗，規范報告解讀，以為臨床提供用藥指導[32]。

不同感染部位CRE的經驗性治療方案不同[29,33]，對于血流感染以及呼吸道感染，推薦高劑量美羅培南聯合多黏菌素；尿路感染推薦高劑量美羅培南聯合磷霉素或者氨基糖苷類抗菌藥物。在臨床治療中，還需要考慮抗生素的體內藥動學及藥效學以及毒副作用，如替加環素在血液、尿液中的濃度低，黏菌素在肺組織的穿透性差[34]，長期應用氯霉素會抑制骨髓，氨基糖苷類抗菌藥物有腎毒性和耳毒性。不同種類的抗菌藥物對產生不同碳青霉烯酶菌株的抗菌活性不同[33]，如頭孢他啶/阿維巴坦對產KPC和OXA-48型絲氨酸碳青霉烯酶菌株具有高度抗菌活性，但對產金屬β內酰胺酶菌株無抗菌活性。此外，可根據不同碳青霉烯酶的特征開展聯合藥敏試驗以制定精準的抗感染治療方案[5]。因此，碳青霉烯酶型的確定非常重要，實驗室應結合自身條件及臨床需求開展碳青霉烯酶型的檢測。

感染途徑不同危害不同、經驗治療策略不同，尤其對于未培養出致病菌但是二代測序等檢出致病菌的危重癥患者，不同感染部位的致病菌的特點及對抗菌藥物的耐藥率的統計分析對于制定抗感染治療方案具有重要意義。CRE引起的感染死亡率高，可選擇的抗菌藥物少。因此，動態監測不同感染部位CRE的檢出情況、菌株分布情況及耐藥情況對于臨床合理使用抗菌藥物、改善患者結局、減輕患者疾病負擔具有重要意義。