HPLC-MS/MS法測定血液病患者血漿中伊布替尼血藥濃度的方法學研究及臨床應用

位 寧，郭進艷，孫文利，王 磊*

(1 漯河市中醫院藥學部，漯河 462000；2 河北燕達陸道培醫院檢驗醫學科，廊坊 065201)

伊布替尼(ibrutinib)是一種高效、高選擇性的口服小分子布魯頓酪氨酸激酶(Brutons tyrosine kinase,BTK)抑制劑，通過選擇性地共價結合靶蛋白BTK活性中心的半胱氨酸殘基(Cys-481)結合位點，不可逆地抑制BTK活性和抑制B細胞抗原受體通路的激活，從而有效地阻止腫瘤細胞從B細胞轉移到適合腫瘤生長的淋巴組織[1]。伊布替尼用于治療套細胞淋巴瘤和慢性淋巴細胞白血病[2]；口服吸收迅速，與血漿蛋白可逆性結合率為97.3%，達峰時間為 1～2 h，進餐時的血藥濃度是空腹服藥時的2～4倍；主要通過肝臟CYP3A代謝，消除半衰期 4～6 h，主要以代謝物形式通過糞便排出體外[3]。研究證明[4-5]，伊布替尼藥動學個體差異大，且與強CYP3A抑制劑或強CYP3A誘導劑同時服用時，其暴露量將會受到影響[血藥濃度時間下面積(area under the curve，AUC)增加或減少10～20倍]?；颊咴谥委熯^程中易出現出血、高血壓等不良反應或者療效不佳甚至治療失敗。臨床醫生在考慮患者依從性差、藥物相互作用等可能的原因之外，還應考慮標準劑量是否為該患者的最佳治療劑量，是否實現了伊布替尼治療效益最大化。這就需要通過檢測血藥濃度來判斷患者體內真實的藥物濃度，從而對患者進行個體化治療，減少不良反應[5]。國外文獻報道了伊布替尼血藥濃度測定的HPLC-MS/MS法[6-8],國內目前尚無關于血液病患者伊布替尼血藥濃度檢測方法的報道。因此，本研究旨在建立測定血液病患者血漿中伊布替尼血藥濃度的HPLC-MS/MS法，并對此方法進行方法學驗證，確保建立的HPLC-MS/MS法可用于臨床常規監測伊布替尼血藥濃度，為伊布替尼的個體化用藥劑量調整提供可靠依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1儀器

島津LC-20A液相色譜串聯AB Sciex 4000 QTRAP型三重四極桿質譜儀(美國AB SCIEX公司)；分析方法軟件為Analyst?MD 1.5.2。

1.1.2試藥

伊布替尼標準品(批號：1-JMO-111-1，Toronto Research Chemicals公司)；伊布替尼-d5標準品(批號：ZZS18062702，Toronto Research Chemicals公司)；伊布替尼膠囊(Pharmacyclics LLC，國藥準字H20170350，規格140 mg)；甲醇(色譜純，美國Fisher公司)；甲酸(色譜純，北京邁瑞達科技有限公司)；乙酸銨(分析純，北京邁瑞達科技有限公司)；屈臣氏蒸餾水(廣州屈臣氏蒸餾水有限公司)。

1.1.3基質及臨床樣本

空白血漿基質為新鮮小牛血清(北京百奧萊博科技有限公司)。收集本院5例服用伊布替尼的慢性淋巴細胞白血病患者的血液樣本，服藥劑量均為560 mg，qd，于給藥后2 h抽血檢測。

1.2 方法

1.2.1色譜條件

Ultimate XB-C18色譜柱(50 mm×4.6 mm,5 μm)，柱溫60 ℃，流動相為含2 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸的水溶液(A)與含0.1%甲酸的甲醇溶液(B)，流速0.8 ml/min。梯度洗脫：0.0～0.5 min，95%B～25%B；0.5～2.0 min，25%B；2.0～2.5 min，25%B～95%B；2.5～3.0 min，95%B。進樣量為1 μl。

1.2.2質譜條件

在電噴霧正離子(ESI+)模式下，以多離子反應監測(MRM)方式進行檢測。離子源參數：離子噴射電壓5500 V，離子源溫度550 ℃，噴霧氣55 psi，輔助加熱氣55 psi，氣簾氣25 psi，碰撞氣medium。同時監測伊布替尼m/z441.3～138.1(定量離子)，伊布替尼m/z441.2～304.1(定性離子)；伊布替尼-d5m/z446.2～138.1。質譜條件見表1；伊布替尼和伊布替尼-d5的碎片離子質譜圖見圖1。

表1 質譜條件

A：伊布替尼；B：伊布替尼-d5圖1 伊布替尼與伊布替尼-d5的二級質譜圖

1.2.3溶液的配制

1.2.3.1 儲備液的配制

精密稱取伊布替尼標準品5.000 mg，用甲醇溶解，多次洗滌，依次轉移至10 ml量瓶中，再用甲醇定容，配制成濃度為0.5 mg/ml的儲備液。同樣精密稱取伊布替尼-d5標準品1.000 mg，用甲醇溶解，配制成濃度為0.1 mg/ml的儲備液，分裝，備用。

1.2.3.2 校準溶液與內標溶液的配制

取0.5 mg/ml的伊布替尼儲備液，用甲醇稀釋成濃度為0.1、0.2、1.0、2.0、10.0、20.0 μg/ml的伊布替尼系列校準溶液。然后取伊布替尼-d5儲備液，用甲醇稀釋，制得濃度為0.25 μg/ml的伊布替尼-d5內標溶液，可沉淀血漿蛋白，作為樣本前處理液使用。

1.2.4樣本處理

取患者外周血樣本3500 r/min離心7 min，取100 μl血漿上清液于1.5 ml離心管中，加入100 μl含0.1%甲酸+2 mmol/L乙酸銨的水溶液，再加入300 μl伊布替尼-d5內標溶液，最后加入500 μl甲醇，渦旋60 s，充分混勻，13 000 r/min離心8 min。移取170 μl上清液于進樣瓶中，進樣1 μl。

1.2.5方法學驗證[9-14]

1.2.5.1 特異性考察

取屈臣氏蒸餾水直接進樣，檢測，得色譜圖A。再取空白血漿100 μl，除不加內標外，其余按照“1.2.4”項進行處理，進樣1 μl，得色譜圖B。將一定濃度的伊布替尼標準溶液和伊布替尼-d5內標溶液加入空白血漿中，除不加內標外，其余按照“1.2.4”項進行處理，進樣1 μl，得色譜圖C。取受試者口服伊布替尼膠囊后的血漿樣品，按照“1.2.4”項進行處理，進樣1 μl，得色譜圖D。比較色譜圖A、B、C、D，查看色譜峰保留時間，得出空白血漿中的內源性物質是否干擾伊布替尼和伊布替尼-d5的檢測。

1.2.5.2 殘留驗證

取濃度為20 μg/ml的伊布替尼標準溶液和空白屈臣氏蒸餾水樣品，按照“1.2.4”項進行處理，依次進樣檢測。

1.2.5.3 基質效應評價

通過評價目標化合物在血漿基質和無血漿基質中的信號值來評價基質效應。選取3個濃度(0.3、3.0、15.0 μg/ml)水平校準液分別置于空白血漿和水中，按“1.2.4”項進行處理，通過血漿中目標化合物(內標)的信號強度與水中目標化合物(內標)的信號強度來計算內標歸一化的基質因子，進而評價基質效應，計算公式參照《中國藥典》2020年版[10]。

1.2.5.4 標準曲線和定量限

取10 μl濃度為0.1、0.2、1.0、2.0、10.0、20.0 μg/ml的伊布替尼系列校準溶液分別加入1.5 ml離心管中，再平行加入90 μl空白血漿，按照“1.2.4”項進行處理。經HPLC-MS/MS分析。以伊布替尼與內標伊布替尼-d5峰面積之比作為縱坐標(y)，以血漿伊布替尼濃度作為橫坐標(x)，采用加權(W=1/x2)最小二乘法進行回歸和線性擬合。連續測3天，每天1條標準曲線。通過評價3條標準曲線，計算線性回歸的相關系數r2，要求r2≥0.9900。以S/N=10，計算定量限。

1.2.5.5 精密度

取空白血漿，分別加入一定體積的伊布替尼儲備液，制備高、中、低(1.50、0.30、0.03 μg/ml)3種濃度的質量控制(QC)樣品，按“1.2.4”項進行處理。每一濃度進行6個樣本分析，連續測定3天。根據當天的標準曲線，計算QC樣品的測定濃度，根據QC樣品的測定濃度計算精密度，要求變異系數(CV)<15%。

1.2.5.6 回收率

取空白血漿，制備高、中、低(1.50、0.30、0.03 μg/ml)3種濃度的QC血漿樣品，各6份。按“1.2.4”項進行處理，經HPLC-MS/MS分析，得到分析物伊布替尼及內標伊布替尼-d5峰面積之比A1。另取空白血漿，經蛋白沉降處理得血漿上清液，制備高、中、低(1.50、0.30、0.03 μg/ml)3種濃度的QC血漿上清液樣品，各6份。按“1.2.4”項進行處理，經HPLC-MS/MS分析，得到分析物伊布替尼及內標伊布替尼-d5峰面積之比A2。以A1/A2比值計算回收率。

1.2.5.7 穩定性試驗

配制伊布替尼高、中、低(1.50、0.30、0.03 μg/ml) 3種濃度的血漿樣品，按“1.2.4”項進行處理，每個濃度3個樣品，考察其在室溫放置24 h、4 ℃冰箱放置24 h、24 h內反復凍融3次的穩定性。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 特異性考察

由圖2可見，伊布替尼保留時間為2.06 min，伊布替尼-d5保留時間為2.06 min，二者色譜行為一致。說明伊布替尼-d5作為伊布替尼的內標較為合適；亦表明血漿中內源性物質不干擾伊布替尼和內標伊布替尼-d5的測定，專屬性良好。

A：空白水；B：空白血漿；C：空白血漿+伊布替尼+伊布替尼-d5；D：患者血漿+伊布替尼-d5圖2 空白水、空白血漿、伊布替尼和伊布替尼-d5色譜圖

2.2 殘留驗證

高濃度樣品后伊布替尼的第一個空白樣品的殘留為15.60%，第二個空白樣品的殘留為4.30%，均小于分析物定量下限20%；高濃度樣品后伊布替尼-d5的第一個空白樣品的殘留為0.10%，第二個空白樣品的殘留為0.07%，低于內標峰面積的5%。見表2。

表2 伊布替尼殘留實驗結果

2.3 基質效應評價

有血漿和無血漿基質中不同加標濃度伊布替尼的內標歸一化基質因子在0.99～1.02之間，CV在1.57%～3.67%之間，小于15%，符合《中國藥典》2020年版[10]要求。見表3。

2.4 標準曲線和定量限

采用內標法進行定量分析，得到直線方程y=0.004 64x+0.004 42，r2=0.9997。表明伊布替尼在10～2000 ng/ml內線性關系良好，最低定量限為1.65 ng/ml。見表4。

表4 伊布替尼標準曲線結果

2.5 精密度

伊布替尼日內RSD為2.84%～5.41%，日間RSD為4.89%～5.19%，二者均小于15%。表明精密度好，數據較集中。見表5。

表5 伊布替尼精密度測定結果 n=6

2.6 回收率

通過計算A1/A2比值，得到回收率為101.31%～102.54%，位于85%～115%之間，準確度較高。見表6。

表6 伊布替尼回收率測定結果 n=6

2.7 穩定性試驗

在相應考察的穩定性條件下，對結果數據進行單因素方差分析，伊布替尼穩定性數據RSD 0.38%～2.93%，小于15%。表明伊布替尼樣品較為穩定，在血中穩定性好，可進行臨床常規血藥濃度檢測。見表7。

表7 伊布替尼穩定性結果

2.8 臨床應用

應用上述建立的檢測伊布替尼血藥濃度的HPLC-MS/MS法，對5例患者伊布替尼血藥濃度進行檢測。結果為：13.2、3.07、7.7、13.3、254 ng/ml，可見服用同一劑量的不同患者的伊布替尼血藥濃度不同，且前4例患者結果都低于正常值37.1 ng/ml[4]。最后1例患者濃度明顯偏高。經詢問，該患者服用了伏立康唑作為抗感染預防用藥。伏立康唑為CYP3A4抑制劑，導致伊布替尼血藥濃度偏高[5]。

3 討論

HPLC-MS/MS可在較短時間內完成待測物的檢測，且具有良好的靈敏度和特異性，成為各種藥物體外研究和體內分析的首選方法[9]。在伊布替尼的臨床前和臨床研究過程中，對生物基質中藥物的定量研究是非常有必要的。Veeraraghavan等[6]在2015年采用甲苯磺丁脲作為內標，同時監測大鼠血清中來那度胺、伊布替尼及其代謝產物。由于選用色譜柱較長，導致出峰時間延長，檢測耗時；選用乙腈作為洗脫劑，提取回收率為75.2%。Beauvais等[7]在2018年建立了同時檢測腦脊液中伊布替尼及其代謝產物的UHPLC-MS/MS法，采用乙腈-水進行梯度洗脫，色譜柱短，出峰時間快，但其線性范圍較窄。Sun等[8]在2019年采用UPLC-ESI-MS/MS法檢測套細胞淋巴瘤大鼠血漿中伊布替尼濃度，采用維拉佐酮作為內標，其出峰時間(0.73 min)與伊布替尼出峰時間(0.51 min)不一致，明顯延后，不利于臨床樣本(血清基質復雜、干擾物質種類多等)檢測。

本研究建立的測定伊布替尼血藥濃度的HPLC-MS/MS法，采用同位素伊布替尼-d5作為內標，能一定程度降低生物基質對伊布替尼含量測定的影響。以甲酸-乙酸銨作為緩沖鹽，甲醇-水梯度洗脫，基質無干擾，出峰時間早，峰型好，且前處理簡單，回收率及精密度和穩定性均較好，線性范圍適宜，可用于臨床常規伊布替尼血藥濃度測定。但在實驗過程中，QC低濃度點準確度和方法回收率雖然符合《中國藥典》2020年版規定范圍，但相對偏高，可能與伊布替尼離子對選擇有關。

在對伊布替尼離子+NH3、+Na、+K峰進行優化時，發現其子離子不穩定或者子離子峰響應低，不能作為常規檢測離子選用。對洗脫梯度和溶劑及色譜柱進行考察，亦發現不能消除此種現象。故選擇本實驗室常用色譜系統對伊布替尼血藥濃度進行臨床常規檢測[15]。本研究建立的測定人血漿中伊布替尼血藥濃度的HPLC-MS/MS法，可以常規測定伊布替尼血藥濃度，為伊布替尼的個體化合理用藥提供支持。由于價格原因，本院目前服用伊布替尼的患者少，伊布替尼血藥濃度與臨床療效的研究還需后續臨床病例的增加而逐步開展。