鳳尾草薄層色譜分離及抗菌活性初步研究

鄒志萱，曾亞丹，韋清慧，包夢瑩，黃媛媛，王亞麗，張興藝，王小鶯

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)/江西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸藥研究所，江西 南昌 330045）

鳳尾草是鳳尾蕨科鳳尾蕨屬植物，主要以其葉形和生態(tài)環(huán)境來命名，如金雞尾、雞腳草、井欄邊草等，喜生長在蔭蔽、濕潤、溫暖處，也耐旱。在南方冬季，石縫中生長的植株經(jīng)歷一二月份的干旱，不致完全枯死。以全草入藥，性涼，味微苦，歸肝、腎、大腸經(jīng)，具有清熱利濕、涼血止血、消腫解毒等功效，用于治療痢疾、腸炎、黃疸型肝炎、吐血、便血、尿血等病癥[1]。

雖然大多數(shù)不同產(chǎn)地的鳳尾草的成分類別可能相同，但是化合物含量不同，所以不同產(chǎn)地鳳尾草的質(zhì)量不同，臨床療效也有差異。為提高鳳尾草的質(zhì)量控制水平，建立和完善相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本項(xiàng)目通過研究不同來源的鳳尾草藥材的薄層色譜法和抑菌圈試驗(yàn)，初步建立一種能夠快速鑒定優(yōu)質(zhì)鳳尾草的薄層色譜指紋圖譜，也可為日后合理開發(fā)該資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 供試藥材

人工種植鳳尾草為南昌市經(jīng)開區(qū)昌盛大藥房購買；野生鳳尾草分別于11月、12月采自江西省南昌市梅嶺風(fēng)景區(qū)。

1.2 菌種

腸桿菌菌株為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 主要試劑

三氯甲烷、石油醚、正己烷、乙酸乙酯、甲酸、乙酸乙酯、甲醇、無水乙醇、硫酸溶液，所有均為市售一般化學(xué)純試劑，購買于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。改良碘化鉍鉀、香草醛、磷鉬酸、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基瓊脂粉末、薄層硅膠板，由青島海洋化工有限公司生產(chǎn)。

1.4 主要儀器

中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)），立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)），恒溫培養(yǎng)搖床（上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)），雙人單面凈化工作臺(SW-CJ-2D，蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)），生化培養(yǎng)箱(韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))；電子天平(ESJ220-4G，沈陽龍騰電子有限公司生產(chǎn))，恒溫培養(yǎng)搖床(SKY-1102C，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn))。

2 方法

2.1 鳳尾草乙醇提取物的制備

取供試材料，去雜清洗干凈，干燥粉碎。稱取鳳尾草粉末10 g，與乙醇溶液1∶5的料液比，浸泡30分鐘后，于50℃溫度加熱回流提取1小時，放冷、過濾、濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶散，用20 mL乙酸乙酯振搖提取，水浴蒸干，殘渣加無水乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液，置冰箱4℃冷藏保存[2]。

2.2 鳳尾草薄層色譜法建立

2.2.1展開劑的篩選

為了得到理想的分離效果，試驗(yàn)中選擇乙酸乙酯-甲酸-水（13∶3∶1），乙酸乙酯-乙醇-水（5∶5∶2），三氯甲烷-乙醇-水（13∶6∶2）等展開系統(tǒng)。

取薄層色譜硅膠G干燥后備用，用微量定樣點(diǎn)樣器點(diǎn)樣于薄層板上，將薄層板放入展開劑飽和后的層析缸中，密封室蓋，展開完畢后，取出薄層板，晾干，后置紫外光燈（365 nm）下檢視。

2.2.2顯色劑的篩選

取出薄層板后晾干，除一片放置于紫外儀365 nm下直接顯色外，其他分別噴以改良碘化鉍鉀溶液、5%香草醛硫酸溶液、10%磷鉬酸乙醇溶液，于干燥箱中110℃干燥5分鐘后取出，觀察斑點(diǎn)顯色情況。

2.3 抗菌活性測定

2.3.1菌液的制備

取-80℃冷凍保存的大腸桿菌凍存管，將其吸入LB液

體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放置于37℃搖床6小時進(jìn)行快速復(fù)蘇，紫外分光光度計測定細(xì)菌數(shù)量，備用。

2.3.2體外抑菌實(shí)驗(yàn)

吸取已復(fù)壯好的菌液100 μL于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基[4]上，用三角涂布棒涂開，瓊脂打孔法打孔，吸取30 μL培養(yǎng)基封底，防止藥液從底部漏出，往平板中分別加入三種不同來源的鳳尾草藥液，并加入溶劑乙醇作為對照，置于37℃恒溫培養(yǎng)12小時，觀察測量抑菌圈。

3 結(jié)果與分析

3.1 鳳尾草薄層色譜法建立

經(jīng)過對不同展開系統(tǒng)薄層色譜分離效果的比較，結(jié)果表明采用展開劑為正己烷∶乙酸乙酯∶甲酸=5∶1∶1，以磷鉬酸乙醇溶液為顯色劑時，斑點(diǎn)清晰，分離效果最好，而通過365 nm紫外儀觀察最為簡便直觀（圖1）。

圖1 鳳尾草的TLC

3.2 不同來源鳳尾草乙醇提取物對大腸桿菌的體外抑菌效果

試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，11月、12月的野生鳳尾草平均抑菌圈直徑分別為29 mm、21 mm，但人工種植鳳尾草乙醇提取物產(chǎn)生的抑菌圈較小，為16 mm。而對照溶劑沒有抑菌圈（表2）。

表2 不同來源鳳尾草提取液對大腸桿菌的抑菌效果

根據(jù)所得到的圖1、表1、表2結(jié)合分析可知，處在同一位置的斑點(diǎn)，表明對應(yīng)條帶的遷移速率在相同實(shí)驗(yàn)條件下可以判斷其為同一個物質(zhì)。與人工種植鳳尾草斑點(diǎn)相比較，采摘的野生鳳尾草提取物的斑點(diǎn)有顯著不同，野生鳳尾草在斑點(diǎn)1、斑點(diǎn)2、斑點(diǎn)3明顯高于人工采摘鳳尾草，而野生鳳尾草其他部位的斑點(diǎn)比人工種植鳳尾草相應(yīng)部位的斑點(diǎn)弱，由此可推測鳳尾草抗菌活性部位為斑點(diǎn)1、斑點(diǎn)2、斑點(diǎn)3，Rf值分別為0.338、0.394、0.451。

表1 鳳尾草主要抗菌物質(zhì)的Rf值

4 討論

從實(shí)驗(yàn)中所得：5%香草醛硫酸溶液在高溫情況下能夠使展開成分顯淺綠色，10%磷鉬酸乙醇溶液能夠使展開成分顯藍(lán)色，改良碘化鉍鉀能夠使展開成分顯橘紅色，對比各類鳳尾草展開后的條帶情況以及不同鳳尾草醇提液的抑菌效果后，推測鳳尾草中起主要抗菌作用的成分是圖1中的斑點(diǎn)1、斑點(diǎn)2、斑點(diǎn)3，根據(jù)所選的顯色劑及文獻(xiàn)分析推薦為萜類成分[4]。

鳳尾草資源豐富，用途廣泛，使用歷史悠久。但由于鳳尾草成分復(fù)雜，因而其分離、鑒定難度極大。因此，開始鳳尾草藥材的研究時，應(yīng)對中藥的提取條件、方法、有效組分分離等作充分考慮，設(shè)置對照組和重復(fù)組，以保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和真實(shí)性。對于日漸增大的市場需求量，現(xiàn)如今鳳尾草的開發(fā)與利用將是大勢所趨，所以建立快速篩查優(yōu)質(zhì)鳳尾草的方法具有重要意義。