阿維來司他對主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞成骨分化的作用及機(jī)制研究*

劉 艷， 安利欽， 朱夢穎， 蔣 鵬， 劉 璐， 劉天瑤， 翁亞光

（重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016）

鈣化性主動脈瓣膜疾病（calcific aortic valve disease，CAVD）是全世界常見的心臟瓣膜疾病之一［1］，最新數(shù)據(jù)表明，每年鈣化性主動脈瓣疾病的全球患病人數(shù)約為1 260 萬，影響著2%左右的70 歲以上老年人群［2］。作為一種長期的慢性疾病，CAVD 的特征是瓣膜小葉進(jìn)行性纖維化、基質(zhì)重塑和鈣化［3］，這一過程不能被逆轉(zhuǎn)，且目前臨床上缺乏有效的藥物治療，因此，尋找合適的藥物干預(yù)CAVD 的發(fā)生或延緩病程，是目前急需解決的問題［4］。

中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastinase，NE）是一種儲存在中性粒細(xì)胞嗜苯胺藍(lán)顆粒中的絲氨酸蛋白酶［5］。在病理狀態(tài)下NE 分泌增多，過度降解細(xì)胞外基質(zhì)，容易導(dǎo)致基質(zhì)重塑［6］。NE 與心血管疾病有密切聯(lián)系，在冠心病患者，尤其是不穩(wěn)定心絞痛和急性心肌梗死患者的血漿中，NE 水平顯著升高，被認(rèn)為是心血管事件的預(yù)測因子［7］。研究表明，敲除NE基因能有效縮小載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊的大小［8］。一些NE 抑制劑已在動脈粥樣硬化［8］和脊髓損傷［9］中展現(xiàn)出良好的保護(hù)作用。阿維來司他（alvelestat；又稱AZD9668）是近年來開發(fā)的一種新型可口服的NE抑制劑，與NE 呈可逆的結(jié)合［10］。臨床研究結(jié)果顯示，alvelestat 可改善支氣管擴(kuò)張患者的肺功能，減少痰中的炎癥因子［11］，并能顯著降低由牙齦卟啉單胞菌引起的大鼠腹主動脈瘤直徑的增加［12］。目前，NE及其抑制劑alvelestat 在主動脈瓣膜疾病中的作用尚未有研究。因此，本項(xiàng)工作擬檢測CAVD 患者瓣膜組織中NE 的表達(dá)水平，采用NE 抑制劑alvelestat 研究其對成骨誘導(dǎo)的主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞（valve interstitial cells，VICs）成骨分化的作用，并進(jìn)一步探討其可能的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 人瓣膜組織和豬主動脈VICs 來源 1 例人正常瓣膜組織取自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心胸外科患有主動脈夾層的患者，3例鈣化瓣膜標(biāo)本來源于行瓣膜置換手術(shù)的CAVD 患者。患者及家屬均已簽署知情同意書。術(shù)中取下的瓣膜立即用無菌磷酸鹽緩沖液漂洗，一部分置于4%多聚甲醛中固定，包埋切片；另一部分置于液氮中保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

豬主動脈瓣膜取自重慶市璧山區(qū)動物檢疫定點(diǎn)屠宰場，選取10 只8～10 月齡健康豬，體質(zhì)量100～180 kg，取下豬瓣膜組織，立即用含1%青霉素/鏈霉素的無菌磷酸鹽緩沖液漂洗3 次，放入無血清無抗生素的M199 培養(yǎng)液中，并置于冰上，30 min 內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞消化分離。本文中的實(shí)驗(yàn)已通過重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院科研倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試劑 M199 培養(yǎng)液購自HyClone；澳洲胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Cellmax；Ⅰ型膠原酶購自Sigma；MTT、β-磷酸甘油二鈉鹽、維生素C、地塞米松、胰蛋白酶和茜素紅染料均購自北京索萊寶科技有限公司；1%青霉素/鏈霉素溶液和堿性磷酸酶染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；阿維來司他購自Selleck；兔抗人骨橋蛋白（osteopontin，OPN）抗體、兔抗人Ⅰ型膠原（type I collagen，collagen I）抗體和兔抗人波形蛋白（vimentin）抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司；鼠抗人Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）抗體購自Santa Cruz；兔抗人α-平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）抗體和兔抗人CD31 抗體購自Abcam；兔抗人細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases 1/2，ERK1/2）抗體和兔抗人p-ERK1/2抗體購自Cell Signaling Technology；鼠抗人GAPDH 抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；PD98059 購自MedChemExpress；兔SP 顯色試劑盒、DAB 顯色試劑盒及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠和山羊抗兔IgG 均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人NE 抗體和熒光兔Ⅱ抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；PVDF 膜和化學(xué)發(fā)光試劑盒均購自Millipore。

2 方法

2.1 原代豬主動脈VICs 的分離與培養(yǎng) 按我們已報(bào)道的方法［13］進(jìn)行原代豬主動脈VICs 分離。在超凈臺中取出豬主動脈瓣膜，用含1%青霉素/鏈霉素的無菌PBS再次漂洗3次，用無菌醫(yī)用棉簽輕輕擦拭瓣膜組織的表面，去除瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞；之后用無菌剪刀剪碎組織，用2 g/L 的Ⅰ型膠原酶于37℃消化組織，待組織呈絮狀后終止消化，700×g離心5 min，去除上清，將組織沉淀物置于含10% FBS 和1%青霉素/鏈霉素的M199 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每3 d 更換一次培養(yǎng)液。待細(xì)胞密度約90%左右進(jìn)行傳代，取第3～7代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 免疫組織化學(xué)染色 術(shù)中取下的人瓣膜組織于4%多聚甲醛中固定，后續(xù)包埋、切片。將石蠟切片于56 ℃烘片2 h，依次用100%、95%、80%和70%乙醇水化。將切片置于0.01 mol/L 的枸櫞酸鈉緩沖液在微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻。加入3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清室溫封閉15 min，滴加適量Ⅰ抗，4 ℃過夜。PBS清洗后滴加相應(yīng)生物素標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫孵育15 min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫下孵育15 min，加入新鮮配制的DAB顯色液5 min，自來水沖洗，蘇木素染色液孵育20 s后用中性樹脂封片。

2.3 免疫熒光染色鑒定細(xì)胞表型 將第3～7 代VICs 接種于24 孔板無菌爬片中，待細(xì)胞生長至約50%密度時(shí)用4%多聚甲醛固定30 min，0.5% Triton X-100進(jìn)行細(xì)胞破膜，室溫孵育20 min。加入3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育15 min，正常山羊血清封閉30 min，滴加1∶50稀釋的Ⅰ抗（兔抗人α-SMA、CD31 和vimentin 抗體），置于4 ℃過夜；加入1∶200稀釋的熒光Ⅱ抗，室溫下避光孵育2 h，用DAPI 復(fù)染細(xì)胞核，于熒光顯微鏡下觀察VICs 中α-SMA、CD31和vimentin的表達(dá)情況。

2.4 MTT 法檢測細(xì)胞活力 將VICs 以每孔5 000個(gè)的密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100 μL培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長至30%左右時(shí)加入不同濃度（0、1、10、20、40、80 和160 nmol/L）的alvelestat 處理細(xì)胞24 h 和48 h，每組5 個(gè)復(fù)孔。藥物處理之后，在相應(yīng)時(shí)點(diǎn)加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出孔內(nèi)液體后每孔加入150 μL DMSO 溶液，用酶標(biāo)儀于492 nm處檢測各孔吸光度（A）。

2.5 VICs 的成骨分化誘導(dǎo) 按我們已報(bào)道的方法配制成骨培養(yǎng)液［13］：M199 培養(yǎng)液中加入10 mmol/L β-甘油磷酸二鈉鹽、50 mg/L 維生素C 和100 nmol/L地塞米松，配制為成骨培養(yǎng)液（osteogenic medium，OM），用于誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化。

2.6 用alvelestat 處理VICs 及實(shí)驗(yàn)分組 取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于相應(yīng)培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞密度達(dá)到60%時(shí)，加入相應(yīng)濃度的alvelestat 處理。實(shí)驗(yàn)分組如下：對照組（blank 組）用正常M199 培養(yǎng)液處理；OM 組用鈣鹽培養(yǎng)液處理；OM+alvelestat 組加相應(yīng)濃度（5、10、20 和40 nmol/L）的alvelestat 處理24 h 或48 h。

2.7 Western blot 實(shí)驗(yàn) 提取細(xì)胞總蛋白。將適量蛋白樣本進(jìn)行10% SDS-PAGE，恒壓90 V 電泳30 min，120 V 電泳60 min，電泳結(jié)束后切下相應(yīng)位置的膠，恒流210 mA 將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后加入相應(yīng)Ⅰ抗（NE、collagen I、RUNX2和OPN抗體1∶500稀釋，α-SMA、ERK1/2和p-ERK1/2 抗體1∶1 000 稀釋，GAPDH 抗體1∶2 000 稀釋）于4 ℃過夜孵育。加入相應(yīng)Ⅱ抗（1∶5 000 稀釋），于37 ℃孵育1 h，洗膜后加入化學(xué)發(fā)光液，于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中檢測相應(yīng)蛋白的表達(dá)情況。用Image Lab 軟件計(jì)算各條帶的灰度值，GAPDH 作為內(nèi)參照，將目的蛋白條帶灰度值與對應(yīng)內(nèi)參照條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)水平。

2.8 堿性磷酸酶染色 取對數(shù)生長期的VICs 接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度達(dá)到40%左右更換為含5% FBS 的M199 培養(yǎng)液，按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行相應(yīng)處理，培養(yǎng)7 d。7 d 后棄去培養(yǎng)液，PBS 清洗3 次，4%多聚甲醛固定30 min，加入BCIP/NBT 工作液200 μL，雙蒸水終止反應(yīng)，觀察染色結(jié)果。

2.9 茜素紅染色 取對數(shù)生長期的VICs 接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度達(dá)到30%左右更換為含2% FBS 的M199 培養(yǎng)液，按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行相應(yīng)處理，培養(yǎng)14 d。14 d 后棄去培養(yǎng)液，PBS 清洗3 次，4%多聚甲醛固定30 min，加入0.4%茜素紅S 溶液，用雙蒸水終止反應(yīng)，觀察染色結(jié)果。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 9 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 鈣化的主動脈瓣膜組織中NE和成骨相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)升高

免疫組化結(jié)果顯示，與正常瓣膜組織相比，CAVD 患者的瓣膜組織中OPN 和NE 的表達(dá)高于非鈣化瓣膜組織，見圖1A。Western blot 結(jié)果證實(shí)，鈣化的瓣膜組織中NE，鈣化指標(biāo)RUNX2 和OPN，以及纖維化指標(biāo)α-SMA 表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.05 或P＜0.01），見圖1B。

Figure 1. Expression levels of NE and osteogenic indicators in calcified aortic valve（AV）tissues. A：the expression of NE and OPN in AV tissue was detected by immunohistochemistry（the black arrows indicate the positive sites；scale bar=100 μm）；B：the protein expression of NE，α-SMA，OPN and RUNX2 was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01vs normal AV group.圖1 鈣化的主動脈瓣膜組織中NE和成骨指標(biāo)表達(dá)水平

2 原代豬主動脈VICs的形態(tài)及表型鑒定

將對數(shù)生長期的VICs 接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h 后貼壁，可見細(xì)胞呈長梭形或不規(guī)則三角形，生長時(shí)呈放射狀。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，分離的細(xì)胞表達(dá)α-SMA和vimentin，而不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31，說明原代VICs分離成功，見圖2。

Figure 2. Phenotype identification of primary porcine aortic valve interstitial cells. Immunofluorescence staining of CD31，α-SMA and vimentin. The scale bar=100 μm.圖2 原代豬主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞表型的鑒定

3 NE抑制劑alvelestat對VICs活力的影響

MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，濃度80 和160 nmol/L 以上的alvelestat 會損害VICs 的活力（P＜0.01），見圖3A；48 h 后，細(xì)胞活力下降為47.5%和21.74%，顯著低于空白組（P＜0.01），見圖3B。因此，在不影響細(xì)胞活力的情況下，為了篩選有效的藥物處理濃度，選取了0～40 nmol/L濃度的alvelestat進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Figure 3. The effect of alvelestat on the viability of valve interstitial cells（VICs）. A：the viability of alvelestat on VICs was detected by MTT method；B：the viability of VICs treated with alvelestat for 48 h. Mean±SD.n=3.**P＜0.01vs 0 nmol/L group.圖3 NE抑制劑alvelestat對瓣膜間質(zhì)細(xì)胞活力的影響

4 NE 抑制劑alvelestat 可抑制成骨誘導(dǎo)的VICs 纖維化

將VICs 接種于培養(yǎng)皿，用OM 誘導(dǎo)24 h 后提取細(xì)胞總蛋白。Western blot結(jié)果顯示，OM組早期纖維化指標(biāo)α-SMA 和collagen I 表達(dá)水平顯著高于blank組（P＜0.01）；在OM 條件下，加入不同濃度（5、10、20和40 nmol/L）的alvelestat，Western blot 結(jié)果顯示，40 nmol/L 的alvelestat 可顯著抑制α-SMA 和collagen I 的表達(dá)（P＜0.05或P＜0.01），見圖4。

Figure 4. Alvelestat inhibited early fibrosis of valve interstitial cells induced by osteogenic medium（OM）. The protein expression levels of α-SMA and collagen I were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.#P＜0.05，##P＜0.01vs blank group；*P＜0.05，**P＜0.01vs OM group.圖4 NE抑制劑alvelestat抑制成骨誘導(dǎo)的瓣膜間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生早期纖維化

5 NE 抑制劑alvelestat 可抑制成骨誘導(dǎo)過程中的VICs向成骨樣表型分化

Western blot 結(jié)果表明，成骨誘導(dǎo)VICs 48 h 后，OM 組成骨指標(biāo)RUNX2 和OPN，以及NE 的表達(dá)水平顯著高于blank 組（P＜0.05 或P＜0.01），5 nmo/L 和10 nmo/L 的alvelestat 對RUNX2、OPN 和NE 的表達(dá)無顯著影響（P＞0.05），40 nmol/L 的alvelestat 可顯著降低NE、RUNX2 和OPN 的表達(dá)水平（P＜0.05 或P＜0.01），見圖5。因此選擇40 nmol/L 作為后續(xù)處理的有效濃度。

Figure 5. Alvelestat inhibited osteogenic differentiation and NE expression of valve interstitial cells induced by osteogenic medium（OM）. The protein expression levels of NE，RUNX2 and OPN were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.#P＜0.05，##P＜0.01vs blank group；*P＜0.05，**P＜0.01vs OM group.圖5 NE抑制劑alvelestat抑制成骨誘導(dǎo)的瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的成骨分化和NE表達(dá)

6 NE 抑制劑alvelestat 可抑制成骨誘導(dǎo)的VICs 早期及晚期成骨分化能力

同正常對照組相比，OM 誘導(dǎo)VICs 7 d 時(shí)，堿性磷酸酶染色增多，14 d 時(shí)，茜紅素染色增強(qiáng)，鈣沉積增多；40 nmol/L 的alvelestat 則可顯著降低堿性磷酸酶染色和鈣沉積，見圖6。

Figure 6. The effect of alvelestat on the osteogenic differentiation of valve interstitial cells（VICs）in early and late stages. A：the early osteogenic differentiation ability of VICs was measured by alkaline phosphatase staining；B：the late osteogenic differentiation ability of VICs was measured by alizarin red staining. OM：osteogenic medium. The scale bar=100 μm.圖6 NE抑制劑alvelestat對瓣膜間質(zhì)細(xì)胞早期及晚期成骨分化能力的影響

7 NE 抑制劑alvelestat 能抑制鈣鹽誘導(dǎo)的ERK1/2信號通路活化

Western blot結(jié)果顯示，與正常瓣膜組織相比，鈣化的瓣膜組織中p-ERK1/2 水平顯著升高（P＜0.01），見圖7A。體外成骨誘導(dǎo)VICs 鈣化過程中，加入40 nmol/L的alvelestat，在不同時(shí)點(diǎn)（0、1、2、4和8 h）檢測ERK1/2 和p-ERK1/2 蛋白水平，Western blot 結(jié)果顯示，與OM 組相比，alvelestat 使p-ERK1/2 蛋白水平在8 h 顯著降低（P＜0.01），而不影響總ERK1/2 蛋白水平（P＞0.05），見圖7B。為進(jìn)一步明確alvelestat 對ERK1/2 信號通路的作用，我們采用ERK1/2 抑制劑PD98059 進(jìn)行驗(yàn)證，Western blot 結(jié)果顯示，alvelestat和PD98059 均能顯著降低NE、RUNX2 和OPN 的蛋白水平（P＜0.05或P＜0.01），見圖7C。

Figure 7. The effect of alvelestat on ERK1/2 signaling pathway. A：the protein levels of ERK1/2 and p-ERK1/2 in the aortic valve（AV）tissues were detected by Western blot；B：the effects of alvelestat on protein levels of ERK1/2 and p-ERK1/2 in valve interstitial cells（VICs）treated with osteogenic medium（OM）and 40 nmol/L alvelestat were detected by Western blot；C：the VICs were treated with OM and 40 nmol/L alvelestat or 10 μmol/L PD98059 for 24 h，and Western blot was used to detect the expression of RUNX2，OPN and NE. Mean±SD.n=3.##P＜0.01vs normal AV group；*P＜0.05，**P＜0.01vs OM group.圖7 NE抑制劑alvelestat對ERK1/2信號通路的影響

討論

長期以來，人們認(rèn)為CAVD 是由于瓣膜小葉的長期磨損造成的一種被動的退化性疾病［14］。如今的研究表明，CAVD 是一種涉及脂質(zhì)沉積和炎癥、纖維化、鈣化等復(fù)雜因素的主動過程［15］。VICs 是構(gòu)成主動脈瓣膜的主要細(xì)胞，在健康的瓣膜組織中VICs 呈靜息狀態(tài)，當(dāng)受到外界刺激，如內(nèi)皮損傷和炎癥等，會向活化狀態(tài)的VICs 轉(zhuǎn)化，此時(shí)瓣膜組織開始發(fā)生纖維化；當(dāng)刺激持續(xù)存在時(shí)，VICs繼而向成骨樣表型轉(zhuǎn)化，瓣膜組織發(fā)生鈣沉積和礦化［16］。本研究結(jié)果顯示，alvelestat 不僅能抑制VICs的早期纖維化，也能在晚期抑制VICs 的成骨分化，具有較好的保護(hù)作用。由于人類VICs 的來源十分有限，目前在CAVD研究領(lǐng)域也多使用和人類同源性較高的豬VICs 作為實(shí)驗(yàn)材料，故在本研究中采用了容易獲得和培養(yǎng)的豬原代VICs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

我們在鈣化的瓣膜組織中觀察到NE 的表達(dá)顯著升高，成骨誘導(dǎo)VICs 鈣化過程中，NE 水平也隨成骨指標(biāo)RUNX2 等升高，這提示NE 可能參與了主動脈瓣膜鈣化的病理過程。但瓣膜鈣化時(shí)NE 水平升高的原因尚不明確。我們的結(jié)果顯示，成骨培養(yǎng)液可誘導(dǎo)VICs 中NE 表達(dá)增加，因此異常鈣鹽沉積可能是NE 升高的原因之一。目前NE 已被證實(shí)參與了多種心血管疾病的病理過程，例如，NE 能促進(jìn)ApoE敲除小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)生［8］，血清中NE 的活性與收縮期高血壓和動脈硬化有關(guān)［17］。目前開發(fā)出的NE 抑制劑多用于治療一些炎癥性疾病，例如，NE 抑制劑西維來司鈉能降低急性肺損傷患者的肺損傷評分，升高氧合指數(shù)［18］，并且能減輕大鼠腦缺血/再灌注后的炎癥反應(yīng)［19］。但由于西維來司鈉和NE 不可逆結(jié)合而形成酰基酶復(fù)合物，導(dǎo)致它有嚴(yán)重的毒副作用，因此在臨床上的使用受到一定的限制［20-21］。而alvelestat 作為新型的NE 抑制劑，由于其與NE 呈可逆結(jié)合，并具有高選擇性和藥物耐受性好的特點(diǎn)，現(xiàn)已進(jìn)入臨床二期研究［11］。目前對于alvelestat 的研究主要聚焦于一些炎性疾病，例如慢性阻塞性肺疾病和囊性纖維化的抗炎作用方面，尚未研究其在心血管疾病中的作用。研究表明，alvelestat 在血液和細(xì)胞水平的IC50分別為44 和48 nmol/L［22］。本研究發(fā)現(xiàn)alvelestat 有效抑制纖維化和鈣化的作用濃度為40 nmol/L，并不呈現(xiàn)劑量依賴性，且當(dāng)alvelestat 濃度在40 nmol/L 以上時(shí)，VICs 的活力降至50%以下，這也與以往研究相符［22］。

ERK1/2 信號通路參與了多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖和凋亡等［23］。白細(xì)胞介素17（interleukin-17，IL-17）能通過激活ERK1/2 促進(jìn)腎臟纖維化［24］。ERK1/2 信號也促進(jìn)了大鼠骨髓間充質(zhì)肝細(xì)胞的成骨分化作用［25］。有研究表明，ERK1/2 信號通路被激活將導(dǎo)致ERK1/2 磷酸化水平升高，從而加速了主動脈瓣膜鈣化的進(jìn)程［26］。ERK1/2 信號通路的抑制劑PD98059 也被證實(shí)能有效抑制VICs 的鈣化［27］。NE也可以通過激活ERK1/2 信號通路并誘導(dǎo)促炎因子IL-8 的產(chǎn)生，從而促進(jìn)香煙提取物引起的小鼠肺氣腫［28］。本研究結(jié)果顯示，alvelestat 能顯著抑制成骨誘導(dǎo)的ERK1/2 信號通路的激活，且alvelestat 和ERK1/2 抑制劑PD98059 均能顯著降低成骨指標(biāo)RUNX2 和OPN 的表達(dá)水平，進(jìn)一步證實(shí)alvelestat 能發(fā)揮與PD98059 相同的抑制ERK1/2 通路活化和減輕VICs 成骨分化的作用。我們還發(fā)現(xiàn)ERK1/2 抑制劑PD98059 同時(shí)也能抑制NE 的表達(dá)，但ERK1/2 信號通路是否能反向調(diào)控NE 的表達(dá)這一機(jī)制尚不清楚，后續(xù)我們將對這一結(jié)果進(jìn)行深入研究。

綜上所述，本研究證實(shí)了在鈣化的瓣膜組織和成骨誘導(dǎo)的VICs 中NE 的表達(dá)水平升高，NE 抑制劑alvelestat 能通過抑制NE 和ERK1/2 信號通路的活化來抑制VICs 的纖維化和成骨分化。在后續(xù)研究中，我們將在動物和細(xì)胞水平研究NE 及其抑制劑alvelestat 對瓣膜鈣化的作用和分子機(jī)制，為以NE 為治療靶點(diǎn)的瓣膜鈣化臨床治療提供參考資料。