角鯊烯通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵死亡減輕腦缺血再灌注損傷*

蔣 霞， 袁鈺萍， 陳舒懷， 段名揚(yáng)， 鄧祖躍△

（1浙江工業(yè)大學(xué)綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江杭州 310014；2浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江杭州 310052）

腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）是指腦組織在經(jīng)歷一段時(shí)間的缺血后，重新供血，被供血區(qū)組織產(chǎn)生大量的活性物質(zhì)造成的腦組織損傷，這種損傷機(jī)制被認(rèn)為與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等有關(guān)［1］。近期研究發(fā)現(xiàn)，鐵離子代謝異常引起的細(xì)胞鐵死亡可能是腦缺血再灌注損傷的重要病理生理機(jī)制［2］。

鐵死亡（ferroptosis）是2012 年才提出的一種新型細(xì)胞死亡方式，是由鐵代謝紊亂和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物大量累積導(dǎo)致細(xì)胞死亡的一系列過(guò)程［2］。鐵死亡與許多疾病密切相關(guān)，如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、腎功能損傷和缺血再灌注損傷等［3］。Fang等［4］報(bào)道，在腦缺血再灌注損傷大鼠的損傷腦區(qū)觀察到鐵蓄積。Tou 等［5］在單側(cè)短暫性大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠模型中發(fā)現(xiàn)腦組織中有大量鐵積累，而鐵死亡抑制劑ferrostatin-1 治療可以減少腦梗死體積，并改善MCAO 引起的行為缺陷。這些研究均表明，鐵死亡與腦損傷密切相關(guān)。在尋找治療缺血再灌注腦損傷的藥物中，有研究者關(guān)注到了以鐵死亡為靶點(diǎn)的藥物。現(xiàn)在臨床上主要是鐵螯合劑、輔酶Q10 和補(bǔ)充硒（Se）等化學(xué)制劑，其應(yīng)用均有一定的局限性，且可選品種比較少，為了更好防治鐵死亡對(duì)缺血再灌注腦損傷的影響，有研究者開(kāi)始尋找抗鐵死亡的天然藥物［6］。許璐等［7］報(bào)道，丹參酮ⅡA 可能通過(guò)抑制脂質(zhì)氧化活性和鐵含量達(dá)到抑制鐵死亡和保護(hù)海馬細(xì)胞的作用。Yu等［8］發(fā)現(xiàn)一種植物來(lái)源的單萜酚——香芹酚，可通過(guò)降低活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的水平，減少鐵沉積和升高谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的水平，即通過(guò)抑制鐵死亡來(lái)抑制缺血再灌注損傷后海馬神經(jīng)元的損害并逆轉(zhuǎn)神經(jīng)功能缺陷。

角鯊烯（squalene，SQU）是深海環(huán)境中的大型鯊魚(yú)肝臟中提取出的天然物質(zhì)，是一種開(kāi)鏈三萜類(lèi)化合物。由6 個(gè)異戊二烯單位構(gòu)成的三萜類(lèi)化合物具有攜氧、降膽固醇、抗氧化、抗輻射和解毒的作用，同時(shí)對(duì)免疫功能及腫瘤的預(yù)防和治療也有一定的生理作用［9-10］，本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，SQU 能拮抗谷氨酸對(duì)腦的毒性損傷［11］。那么SQU 對(duì)CIRI 腦組織損傷是否有作用，目前還沒(méi)有明確報(bào)道，本次實(shí)驗(yàn)的目的是證實(shí)角鯊烯對(duì)腦缺血再灌注損傷腦組織的保護(hù)作用，進(jìn)一步了解角鯊烯調(diào)節(jié)CIRI 是否與鐵死亡相關(guān)并探討可能的機(jī)制，為角鯊烯的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 藥品、試劑和儀器 藥用植物油（西安天正藥用輔料有限公司）；角鯊烯膠丸（浙江海力生）；去鐵敏（deferoxamine，DFO）；鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin、鐵死亡的強(qiáng)效抑制劑鐵抑素1（ferrostatin-1，F(xiàn)er-1）為Selleck 產(chǎn)品；TTC 染液、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、組織鐵測(cè)定試劑盒和ROS 測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成；Ⅰ抗：GPX4、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor 1，TFR1）和乙酰輔酶A 合成酶長(zhǎng)鏈家族成員4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）購(gòu)自Santa Cruz；SLC7A11、膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ferroportin 1，F(xiàn)PN1）購(gòu)自Abcam；GAPDH、Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、青霉素/鏈霉素抗生素均購(gòu)自碧云天；Ⅱ抗（Bioworld）；FeCl3、DMSO、MTT、DMEM 培養(yǎng)液、0.25%胰酶和磷酸鹽緩沖液（PBS）均購(gòu)自Gibco；新生牛血清（天杭生物）。Spectra Max190 酶標(biāo)儀（Molecuar Devices）；AI6000 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（GE）；RM2400型切片機(jī)、生物顯微鏡（Leica）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性，體質(zhì)量180～200 g，清潔級(jí)，購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［許可證號(hào)為SCXK（浙）2019-0002］。每天12 h光照（光照時(shí)間為8∶00～20∶00），自由飲食飲水，環(huán)境溫度為20～22 ℃，相對(duì)濕度為75%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

2 方法

2.1 大鼠CIRI 模型的建立 按參考文獻(xiàn)［12］中的MCAO 方法稍改良建立大鼠CIRI模型，首先用2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠（ip，3 mL/kg），于其頸部正中間切開(kāi)，逐步剝離出頸部總動(dòng)脈、頸外和頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸部總動(dòng)脈的遠(yuǎn)端剪一個(gè)0.4 mm 左右的V 型切口，從切口插入線栓入頸總動(dòng)脈，然后不停調(diào)整角度，使線栓向前到達(dá)頸內(nèi)動(dòng)脈和大腦中動(dòng)脈，固定線栓，制造缺血模型，120 min 后拔出線栓，實(shí)現(xiàn)再灌注，縫合。假手術(shù)組處理同于模型組手術(shù)，不插線栓。12 h 后，參照后面所列的Zea-Longa 改良后評(píng)分法對(duì)造模大鼠進(jìn)行評(píng)分，得分在1～3 分的大鼠為造模成功大鼠，去掉造模不成功的大鼠，并用同一批次的合格模型補(bǔ)足數(shù)目。

2.2 動(dòng)物分組與給藥 60 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（sham）組、MCAO 組、低、中、高劑量（20、40和80 mg·kg-1·d-1灌胃）SQU 處理組（MCAO+SQU-L、MCAO+SQU-M、MCAO+SQU-H 組）和MCAO+DFO（100 mg·kg-1·d-1腹腔注射）陽(yáng)性組，每組10 只。在模型建立前3 d 開(kāi)始給藥，每天1 次灌胃給藥，陽(yáng)性組灌胃溶劑，假手術(shù)組和模型組腹腔注射0.9% NaCl；造模后給藥7 d，最后1 d 進(jìn)行行為學(xué)檢查，處死動(dòng)物，取腦組織凍于液氮備用。

2.3 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 再灌注12 h 和72 h 后，采用Longa改良評(píng)分法對(duì)大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分：無(wú)癥狀為0 分，無(wú)法伸展對(duì)側(cè)前爪為1 分，大鼠向左側(cè)轉(zhuǎn)圈為2 分，行走時(shí)向偏癱一側(cè)傾斜為3 分，無(wú)自發(fā)活動(dòng)或意識(shí)障礙為4分。

2.4 大鼠腦組織的TTC 染色 大鼠腦組織取下后，先放置于-20 ℃冰箱中冷凍至硬，行冠狀切片，每片厚2 mm，切出5片，放置于2%TTC染液中，37 ℃避光孵育30 min后，用4%多聚甲醛固定30 min后，拍照，采用Image-Pro plus 7.0 軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算大鼠腦部梗死灶體積。

2.5 FeCl3誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷模型的建立及分組 將PC12 細(xì)胞（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予）以1×108/L 的密度接種于96 孔板，24 h 后吸去培養(yǎng)基。然后加入含200 μmol/L FeCl3的培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h，換培養(yǎng)基，建立鐵死亡模型。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照（control）組、FeCl3（200 μmol/L）組、FeCl3+SQU（80 mg/L）組、FeCl3+erastin（5 μmol/L）組、Fe-Cl3+Fer-1（5 μmol/L）組、FeCl3+SQU+erastin 組、Fe-Cl3+SQU+Fer-1 組和FeCl3+DFO（400 μmol/L）組，每組6個(gè)復(fù)孔，37 ℃，5%CO2孵育。加藥24 h后于倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和存活率檢測(cè)，收集各組細(xì)胞凍存?zhèn)溆谩８鹘M給藥劑量參考了相關(guān)文獻(xiàn)和前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.6 鐵離子含量、ROS 熒光強(qiáng)度及GSH 和MDA 含量的檢測(cè) 取腦缺血再灌注損傷大鼠梗死交界區(qū)組織/各組PC12細(xì)胞勻漿，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作測(cè)定鐵離子含量、ROS 熒光強(qiáng)度及GSH 和MDA含量。

2.7 細(xì)胞線粒體跨膜電位的檢測(cè) 各組PC12 細(xì)胞在加藥處理24 h后，吸去培養(yǎng)液，加入100 μL培養(yǎng)液和100 μL JC-1 染色工作液，混勻，37 ℃孵育20 min后用JC-1緩沖液洗滌2次，加入200 μL培養(yǎng)液，顯微鏡下觀察并拍照。比較各組細(xì)胞的線粒體跨膜電位變化情況。

2.8 Western blot 法檢測(cè)鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 取腦缺血再灌注損傷大鼠梗死交界區(qū)組織/各組PC12 細(xì)胞提取總蛋白，試劑盒蛋白定量后進(jìn)行Western blot 檢測(cè)：電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育Ⅰ抗、Ⅱ抗，顯色，以GAPDH 為內(nèi)參照，應(yīng)用圖像分析軟件Image J進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析后，用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行各組間均數(shù)的兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 SQU對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能的影響

術(shù)后12 h 和72 h，與假手術(shù)組相比，MCAO 模型組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分增加（P＜0.05），提示該模型對(duì)大鼠的神經(jīng)功能有明顯的損傷。與模型組相比，SQU 各劑量和DFO 干預(yù)組的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均小于模型組，呈劑量依賴性，其中MCAO+SQU-H 和MCAO+DFO 組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分較MCAO 組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明SQU 和DFO 均改善大鼠受損的神經(jīng)功能。與術(shù)后12 h 相比，各組大鼠在72 h 的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分都有所降低，說(shuō)明大鼠有一定自愈能力，但各給藥組的恢復(fù)更好，見(jiàn)表1。

表1 角鯊烯對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠MCAO 術(shù)后12 和72 h 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及腦組織鐵含量、ROS 熒光強(qiáng)度、GSH 水平和MDA水平的影響Table 1. Effects of squalene（SQU）on neurobehavioral scores 12 and 72 h after MCAO，and iron content，ROS fluorescence intensity，GSH level and MDA level in the brain tissue of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury（Mean±SD）

2 角鯊烯對(duì)腦缺血大鼠腦梗死體積的影響

假手術(shù)組沒(méi)有梗死區(qū)，而模型組出現(xiàn)明顯的腦梗死灶，梗死體積為（24.33±3.14）mm3，與假手術(shù)組相比顯著升高（P＜0.01）；SQU 低、中、高劑量組和DFO 組的腦梗死體積分別為（20.68±2.13）mm3、（17.86±1.69） mm3、（7.42±1.49） mm3和（7.43±1.25）mm3，與MCAO 組比較，MCAO+SQU-M 組、MCAO+SQU-H 組和MCAO+DFO 組的梗死體積均降低（P＜0.05），而MCAO+SQU-L 組腦梗死體積有輕度降低，但較MCAO 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1。

Figure 1. Effect of squalene（SQU）on infarct volume induced by cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Mean±SD.n=3.**P＜0.01vs sham group；#P＜0.05vs model group.圖1 角鯊烯對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死體積的影響

3 角鯊烯對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠氧化損傷相關(guān)指標(biāo)的影響

與假手術(shù)組相比，MCAO 組損傷腦組織中鐵離子含量、ROS 熒光強(qiáng)度和MDA 水平明顯升高，GSH水平明顯降低（P＜0.05）；與MCAO 組比較，SQU 各劑量組鐵離子含量、ROS 熒光強(qiáng)度和MDA 水平逐漸降低，GSH 水平逐漸升高，基本呈濃度依賴性，MCAO+DFO組結(jié)果與MCAO+SQU-H組相接近，見(jiàn)表1。

4 角鯊烯對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組相比，MCAO 組腦組織中SLC7A11、GPX4 和FPN1 表達(dá)降低，ACSL4 和TFR1 表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組相比，MCAO+SQU 組和MCAO+DFO 組的SLC7A11、GPX4 和FPN1 表達(dá)出現(xiàn)不同程度的增加，ACSL4 和TFR1 的表達(dá)出現(xiàn)不同程度的降低，除MCAO+SQU-L 組的FPN1 的蛋白表達(dá)較模型組差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

Figure 2. Effects of squalene（SQU）on the expression of ferroptosis-related proteins in rats with cerebral ischemia reperfusion injury.Mean±SD.n=3.*P＜0.05vs sham group；#P＜0.05vs MCAO group.圖2 角鯊烯對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

5 角鯊烯對(duì)FeCl3誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞形態(tài)學(xué)和存活率影響

與空白對(duì)照組相比，F(xiàn)eCl3組的細(xì)胞數(shù)目顯著減少，出現(xiàn)明顯損傷，細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05）；與FeCl3組相比，F(xiàn)eCl3+erastin 組細(xì)胞損傷更嚴(yán)重，死亡細(xì)胞數(shù)目增加，細(xì)胞存活率進(jìn)一步降低（P＜0.05），而FeCl3+SQU 組、FeCl3+Fer-1 組、FeCl3+DFO 組、Fe-Cl3+SQU+Fer-1 組存活細(xì)胞數(shù)目增加（P＜0.05），F(xiàn)e-Cl3+SQU+erastin 存活細(xì)胞數(shù)目稍有增加，但差異較FeCl3組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與FeCl3+erastin組比較，F(xiàn)eCl3+SQU+erastin 存活細(xì)胞數(shù)目有所增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與FeCl3+Fer-1 組比較，F(xiàn)eCl3+SQU+Fer-1 組的存活細(xì)胞數(shù)目進(jìn)一步增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

Figure 3. Effect of squalene（SQU）combined with erastin and Fer-1 on morphological change and viability of PC12 cells induced by FeCl3. The scale bar=100 μm. Mean±SD.n=3.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs FeCl3 group；△P＜0.05vs FeCl3+erastin group；▲P＜0.05vs FeCl3+Fer-1 group.圖3 角鯊烯與erastin和Fer-1聯(lián)合用藥對(duì)FeCl3誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞形態(tài)和存活率的影響

6 角鯊烯對(duì)FeCl3誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞模型氧化損傷相關(guān)指標(biāo)的影響

與空白對(duì)照組比較，F(xiàn)eCl3誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型組鐵離子含量、ROS熒光強(qiáng)度和MDA水平升高，GSH水平降低（P＜0.05）；與FeCl3組比較，F(xiàn)eCl3+erastin 組的鐵離子含量、ROS熒光強(qiáng)度和MDA水平升高，GSH水平降低（P＜0.05），其余各組鐵離子含量、ROS熒光強(qiáng)度和MDA 水平出現(xiàn)不同程度的降低，GSH 水平出現(xiàn)不同程度的升高，其中FeCl3+SQU+Fer-1 組變化最明顯（P＜0.05）；與FeCl3+erastin 組比較，F(xiàn)eCl3+SQU+erastin 組鐵離子含量、ROS 熒光強(qiáng)度和MDA 水平降低，GSH 水平升高（P＜0.05）；與FeCl3+Fer-1 組比較，F(xiàn)eCl3+SQU+Fer-1 組鐵離子含量、ROS 熒光強(qiáng)度和MDA 水平進(jìn)一步降低，GSH 水平進(jìn)一步升高（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 角鯊烯與erastin和Fer-1聯(lián)合用藥對(duì)FeCl3誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞鐵含量、ROS熒光強(qiáng)度、GSH水平和MDA水平的影響Table 2. Effect of squalene（SQU）combined with erastin and Fer-1 on iron content，ROS fluorescence intensity，GSH level and MDA level in the PC12 cells induced by FeCl3（Mean±SD. n=3）

7 角鯊烯對(duì)FeCl3誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞線粒體跨膜電位的影響

與空白對(duì)照組相比，模型組的線粒體跨膜電位明顯下降，說(shuō)明FeCl3對(duì)PC12細(xì)胞的損傷可以顯著降低線粒體跨膜電位；與FeCl3模型組相比，除FeCl3+erastin 組線粒體膜電位下降更為明顯，其他組的線粒體膜電位均有不同程度的升高，說(shuō)明SQU 和DFO的給藥減輕了FeCl3誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的損傷，且鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin 的使用降低了SQU 的修復(fù)能力，而與抑制劑Fer-1 的聯(lián)合用藥對(duì)損傷恢復(fù)的效果更好，見(jiàn)圖4。

Figure 4. Effect of squalene（SQU）combined with erastin and Fer-1 on mitochondrial transmembrane potential in PC12 cells induced by FeCl3（×200）.圖4 角鯊烯與erastin、Fer-1聯(lián)合用藥對(duì)FeCl3誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞線粒體膜電位的影響

8 角鯊烯對(duì)FeCl3誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

在PC12 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照組相比，F(xiàn)eCl3模型組SLC7A11、GPX4 和FPN1 表達(dá)水平降低，ACSL4和TFR1表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與FeCl3模型組比較，F(xiàn)eCl3+SQU 組、FeCl3+DFO 組和FeCl3+Fer-1 組的SLC7A11、GPX4 和FPN1 表達(dá)水平升高，ACSL4 和TFR1 表達(dá)水平降低（P＜0.05），而FeCl3+erastin 組SLC7A11、GPX4 和FPN1 表達(dá)水平降低，ACSL4 和TFR1 表達(dá)水平升高，除GPX4 和TFR1 蛋白外，其他蛋白的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與FeCl3+erastin 組比較，F(xiàn)eCl3+SQU+erastin 組SLC7A11、GPX4和FPN1 表達(dá)水平升高，ACSL4 和TFR1 表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與FeCl3+Fer-1 組比較，F(xiàn)eCl3+SQU+Fer-1 組SLC7A11、GPX4 和FPN1 表達(dá)水平進(jìn)一步升高，ACSL4 和TFR1 表達(dá)水平進(jìn)一步降低（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

Figure 5. Effect of squalene（SQU）combined with erastin and Fer-1 on the expression of ferroptosis-related proteins in the PC12 cells induced by FeCl3. Mean±SD.n=3.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs FeCl3 group；△P＜0.05vs FeCl3+erastin group；▲P＜0.05vs FeCl3+Fer-1 group.圖5 角鯊烯與erastin、Fer-1聯(lián)合用藥對(duì)FeCl3誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

討論

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予SQU 的大鼠與模型組大鼠比較，其神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分降低，梗死體積均減小，神經(jīng)元細(xì)胞的損傷減輕，并存在劑量依耐性，說(shuō)明SQU 對(duì)CIRI 大鼠腦組織有保護(hù)作用。有研究報(bào)道，因?yàn)镃IRI 與脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞內(nèi)高水平鐵含量等鐵死亡相關(guān)信號(hào)密切相關(guān)［13--14］，本次實(shí)驗(yàn)又設(shè)計(jì)了FeCl3誘導(dǎo)鐵死亡細(xì)胞模型，進(jìn)一步研究SQU 對(duì)CIRI 過(guò)程中鐵死亡相關(guān)通路的影響，了解其可能的調(diào)控機(jī)制。

鐵死亡涉及多條通路，其中包括鐵代謝失調(diào)、脂質(zhì)代謝異常和氧化損傷等，其過(guò)程為CIRI 改變腦內(nèi)相關(guān)分子，導(dǎo)致了鐵的負(fù)載，鐵累積使細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵池的鐵含量升高，這些增加的二價(jià)鐵通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基和脂氧合酶途徑催化脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平的增加；脂代謝增加膜磷脂上的多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs），使其易受ROS攻擊導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化；當(dāng)細(xì)胞無(wú)法通過(guò)抗氧化機(jī)制有效清除胞內(nèi)ROS，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化物質(zhì)積累，從而使細(xì)胞死亡［2，15-18］。以鐵和PUFAs 為原料推動(dòng)了鐵死亡的發(fā)生，同時(shí)以GSH 為底物的GPX4則反向調(diào)控鐵死亡［2，15］。

在鐵死亡相關(guān)的各通路中有各自的關(guān)鍵分子，鐵代謝中TFR1蛋白與Fe3+進(jìn)入細(xì)胞，而FPN1負(fù)責(zé)將細(xì)胞內(nèi)多余的鐵釋放入細(xì)胞間隙［19］。脂質(zhì)過(guò)氧化相關(guān)機(jī)制主要是Xc-/GPX4系統(tǒng)，系統(tǒng)Xc-是存在于膜表面的胱氨酸/半胱氨酸-谷氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其輕鏈亞基（SLC7A11）是活性指標(biāo)，GPX4 是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶系的一員，在保護(hù)細(xì)胞免受脂質(zhì)過(guò)氧化、抑制鐵死亡的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用［20］，GSH與GPX4結(jié)合發(fā)揮清除脂質(zhì)過(guò)氧化的作用，是鐵死亡的特異性指標(biāo)［21］。脂質(zhì)代謝過(guò)程中，ACSL4 和溶血卵磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶3（lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3）通過(guò)調(diào)控不飽和脂肪酸（如花生四烯酸和腎上腺酸）的轉(zhuǎn)化，改變膜磷脂的穩(wěn)態(tài)，是脂肪酸代謝的關(guān)鍵因素［16，22］。本研究中，TFR1 表達(dá)增加，F(xiàn)PN1 表達(dá)降低，鐵含量增加，產(chǎn)生大量ROS，SLC7A11 表達(dá)降低，谷氨酸半胱氨酸交換減少，使GSH 含量減少，進(jìn)而使得GPX4 的活性下降，細(xì)胞清除脂質(zhì)過(guò)氧化物能力不足，而ACSL4表達(dá)增加，增加了神經(jīng)元膜磷脂的多不飽和脂肪酸的磷脂含量，使膜更易受到氧化攻擊，產(chǎn)生了更多的氧化產(chǎn)物如MDA等，這些脂質(zhì)過(guò)氧化累積在線粒體膜，使線粒體膜電位下降，發(fā)生細(xì)胞鐵死亡，進(jìn)而使神經(jīng)功能受損。

許多天然產(chǎn)物對(duì)抑制細(xì)胞鐵死亡有明顯效果，如黃芩素、遠(yuǎn)志皂苷元［22-23］可抑制鐵累積，降低脂質(zhì)過(guò)氧化水平，抑制鐵死亡。SQU 作為海洋生物鯊魚(yú)肝臟的天然物，因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)而具備很多生理功能［24］。本研究結(jié)果顯示，SQU 可以降低缺血再灌注損傷腦組織中鐵離子含量，因?yàn)镾QU 可以降低腦組織TFR1表達(dá)來(lái)降低鐵的來(lái)源，增加FPN1表達(dá)，增加鐵的排出，使細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵池的鐵含量降低；SQU抑制了氧自由基引起的腦突觸體釋放谷氨酸，改善腦損傷后胞外高谷氨酸濃度的微環(huán)境，從而減弱谷氨酸對(duì)天冬氨酸的刺激，導(dǎo)致天冬氨酸蛋白表達(dá)相應(yīng)下調(diào)，進(jìn)一步降低細(xì)胞的鐵攝取。因?yàn)樘於彼崾荏w刺激可通過(guò)TFR1 和二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 誘導(dǎo)分子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元鐵攝取增加［25-27］。本次實(shí)驗(yàn)在鐵死亡細(xì)胞模型中給予SQU 也獲得與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相同的降低鐵死亡的結(jié)果，另外，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，還增加了鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin，結(jié)果顯示erastin增加了TFR1 的表達(dá)，加重了鐵死亡模型細(xì)胞的死亡，但SQU 對(duì)TFR1 的抑制作用，減輕了erastin 加重的細(xì)胞鐵死亡，證明了SQU對(duì)鐵代謝的調(diào)控作用。

SQU 可使腦組織中脂肪酸代謝的關(guān)鍵分子ACSL4蛋白的表達(dá)水平下降，使易氧化損傷的膜磷脂減少，使膜的穩(wěn)定性增加［28］，本次實(shí)驗(yàn)中也觀察到SQU使鐵死亡模型細(xì)胞的線粒體跨膜電位增加，細(xì)胞存活增加，但SQU 調(diào)節(jié)ACSL4 蛋白表達(dá)的具體機(jī)制還不清楚，將在下一步研究。

SQU 在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，表現(xiàn)出強(qiáng)的抗氧化能力，SLC7A11 和GPX4 表達(dá)水平上調(diào)、GSH 含量增加及MDA 水平降低，其機(jī)制可能與SQU 的化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)有似β-胡蘿卜素的異戊間二烯化合物，含有多個(gè)不飽和烴，能結(jié)合多種自由基，發(fā)揮抗氧化作用有關(guān)［29］。SQU 上調(diào)SLC7A11 蛋白表達(dá)，增加了半胱氨酸的交換，有利于GSH 生成，從而上調(diào)了GPX4 的活性，促進(jìn)毒性脂質(zhì)過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)化為無(wú)毒脂醇的效率，降低MDA 含量，達(dá)到降低脂質(zhì)過(guò)氧化水平，改善神經(jīng)元損傷的作用［30］。本課題組在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中使用鐵死亡拮抗劑Fer-1 發(fā)現(xiàn)，SQU 可和Fer-1 有相互促進(jìn)的抗鐵死亡作用，主要表現(xiàn)二者合用比單獨(dú)用任意一種藥物更能降低鐵死亡模型細(xì)胞MDA 水平，增加線粒體跨膜電位，進(jìn)一步增加細(xì)胞存活率。

本研究結(jié)果證實(shí)了SQU 對(duì)CIRI 大鼠腦組織有保護(hù)作用，而其保護(hù)作用與調(diào)控鐵死亡相關(guān)的3 條通路（鐵代謝、脂質(zhì)代謝和氧化損傷）密切相關(guān)，具體表現(xiàn)為為降低細(xì)胞內(nèi)鐵含量，改善脂肪酸代謝，增加細(xì)胞抗氧化作用。