基于NRG/ErbB通路探討三七總皂苷對偏頭痛大鼠的作用機制*

李祥欣， 張保朝， 劉義鋒， 劉少哲， 裴 雙， 余 洋， 溫昌明

（南陽市中心醫院，河南南陽 473000）

偏頭痛臨床表現為頭部搏動樣疼痛的中樞神經系統功能障礙疾病，病程復雜，反復發作，常伴有惡心、嘔吐等癥狀，嚴重影響患者生活質量［1］，但發病機制目前尚不明確。目前臨床上常用曲普坦類藥物治療偏頭痛，但效果不佳，且不能從根本上治療疾病［2］，因此尋找新的治療方案對于緩解疾病意義重大。三七總皂苷（total saponins ofPanax notoginseng，TSPN）作為三七的有效成分，對神經功能具有保護作用［3］，但具體機制尚不清楚。神經調節蛋白（neuregulin，NRG）/表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，ErbB）信號通路作為腦神經元中信號傳導通路，對神經元具有保護作用［4］；在抑郁大鼠模型中能保護神經元免受損傷，實現對疾病的緩解［5］，但尚未顯示其在偏頭痛中的研究。因此，本研究采用硝酸甘油溶液皮下注射制備偏頭痛大鼠模型，探討TSPN 對偏頭痛的保護機制，以期為臨床上TSPN治療偏頭痛提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 動物

48 只SD 大鼠（SPF 級、雄性），6 周齡，體重（190±10）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號為SCXK（京）2016-0011。溫度（23±0.5）℃、濕度（50±5）%、12 h 光照/12 h 黑暗條件下正常飲水攝食。本研究實驗動物符合3R 原則，本研究遵守國際疼痛研究協會實驗動物護理和指南有關規定，經本院倫理協會審核并通過。

2 主要試劑

硝酸甘油溶液（北京益民藥業有限公司，批準文號：國藥準字H11020289，規格：1 mL：5 mg×1支/盒）；三七總皂苷片（滇虹藥業集團玉溪生物制藥有限公司，批準文號：國藥準字Z53021487）；NRG/ErbB 通路抑制劑AG825（Biosource）；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色液（北京索萊寶科技有限公司，貨號：G1120）；大鼠白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、β-內啡肽（β-endorphin，β-EP）、降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒及NRG1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、caspase-3 和cleaved caspase-3 抗體（Abcam，貨號分別為：ab234570、ab255730、ab114804、ab274398、ab203548、ab191139、ab237715、ab32121、ab19391、ab184787 和ab52072）；大鼠一氧化氮（nitric oxide，NO）ELISA 試劑盒（上海潤裕生物科技有限公司，貨號：18941）。ChemiDoc XRS+蛋白成像系統（Bio-Rad）。

3 主要方法

3.1 實驗分組及建模 SD 大鼠隨機分為對照組（control group）、模型組（model group）、TSPN 組（TSPN group；10 mg/kg TSPN）和TSPN+抑制劑組（TSPN+inhibitor group；10 mg/kg TSPN+50 μg/kg AG825），每組12 只。TSPN 組參考人與動物等效劑量換算法灌胃10 mg/kg TSPN［6］，TSPN+抑制劑組在TSPN 組基礎上尾靜脈注射50 μg/kg AG825，對照組和模型組分別灌胃和靜脈注射等體積生理鹽水，每天1次，連續1周。

末次給藥1 h 后，模型組、TSPN 組和TSPN+抑制劑組大鼠參考Tassorelli 等［7］方法建立偏頭痛模型：大鼠按10 mg/kg（2 mL）劑量硝酸甘油溶液皮下注射，當大鼠出現耳紅、爬籠、撓頭、咬尾、往返運動增加等現象，則為造模成功。對照組大鼠相同部位注射等體積生理鹽水。

3.2 各組行為學評分 記錄各組大鼠連續30 min內出現爬籠、撓頭、咬尾和往返運動次數，每個癥狀出現1 次記1 分［8］，以造模成功為0 min，共記錄0～30 min、60～90 min 和120～150 min 三個時段。觀察耳紅出現時間和耳紅消失時間。

3.3 樣本收集 實驗結束后腹主動脈采血，加入促凝管中，1 200×g離心10 min，收集血清，置于-20 ℃冰箱備用；斷頭處死，取腦組織，隨機6 只置于4%多聚甲醛中固定，另6只置于-80 ℃冰箱保存。

3.4 HE 染色檢測腦組織神經元形態 取出4%多聚甲醛中固定組織，石蠟切片（厚度：5 μm），二甲苯脫蠟、乙醇水合，經蘇木精染色、鹽酸分化、伊紅復染后，顯微鏡下觀察腦組織神經元形態。

3.5 ELISA 檢測血清中NO、IL-6 和IL-1β 水平及腦組織中5-HT、β-EP和CGRP含量 取出血清，參考大鼠ELISA試劑盒說明書檢測血清中NO、IL-6和IL-1β水平；腦組織取0.5 mg，加入預冷的磷酸鹽緩沖液，冰上勻漿，1 200×g離心25 min，取上清，參考大鼠ELISA 試劑盒說明書檢測腦組織中5-HT、β-EP 和CGRP含量。

3.6 Western blot 法檢測腦組織中NRG1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、caspase-3 和cleaved caspase-3 蛋白表達情況 取30 mg 腦組織，冰上勻漿，RIPA 裂解液裂解組織，10 000×g、4 ℃離心20 min，上清為總蛋白，上樣20 μg 蛋白、PVDF 膜轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入Ⅰ抗（NRG1，1∶1 000；ErbB2，1∶1 000；ErbB3，1∶500；ErbB4，1∶500；caspase-3，1∶2 000；cleaved caspase-3，1∶2 000）于4 ℃孵育過夜；加入對應Ⅱ抗，室溫孵育1 h；ECL 化學發光液避光顯色，蛋白成像系統拍照和定量分析。

4 統計學處理

數據均采用GraphPad Prism7.0進行分析。計量資料以均數±標準差（mean±SD）描述。多組間比較行單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 TSPN對大鼠頭痛發作時行為學和耳紅的影響

與對照組相比，模型組和TSPN+抑制劑組在0～30 min、60～90 min 和120～150 min 的行為學評分，以及TSPN 組在0～30 min和60～90 min的行為學評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，TSPN 組在0～30 min、60～90 min 和120～150 min 的行為學評分，以及TSPN+抑制劑組在60～90 min 和120～150 min 的行為學評分顯著降低（P＜0.05），TSPN 組耳紅出現時間延長（P＜0.05），TSPN 組和TSPN+抑制劑組耳紅消失時間縮短（P＜0.05）；與TSPN 組相比，TSPN+抑制劑組在0～30 min、60～90 min 和120～150 min 行為學評分升高（P＜0.05），耳紅出現時間縮短（P＜0.05），耳紅消失時間延長（P＜0.05），見圖1、2。

Figure 1. Comparison of behavioral scores during headache attack of the rats in the 4 groups. Mean±SD.n=12.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs model group；＆amp;P＜0.05vs TSPN group.圖1 4組大鼠頭痛發作時行為學評分比較

Figure 2. The appearance time and disappearance time of the rats in the 4 groups were compared. A：ear red appearance time；B：ear red disappearance time.Mean±SD.n=12.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs model group；＆amp;P＜0.05vs TSPN group.圖2 4組大鼠耳紅出現時間和耳紅消失時間比較

2 TSPN對大鼠腦組織神經元的影響

對照組腦組織神經元染色均勻，細胞未腫脹、壞死；模型組神經元出現明顯空泡狀，細胞萎縮、壞死嚴重，出現局部壞死、血管阻塞現象；TSPN 組神經元損傷得到一定修復，神經元僅存在部分空泡現象；TSPN+抑制劑組細胞空泡現象明顯，出現部分血管阻塞現象，見圖3。

Figure 3. Neurons in brain tissues of the rats in the 4 groups（HE staining，scale bar=100 μm）. A：control group；B：model group；C：TSPN group；D：TSPN+inhibitor group. Long arrow：vascular obstruction；short arrow：atrophic cells；H：local necrosis；V：vacuole cells. Obvious vacuoles，cell atrophy，severe necrosis，local necrosis，and blood vessel obstruction were observed in model group. Partial vacuolation was observed in TSPN group. Cellular vacuolation was obvious in TSPN+inhibitor group.圖3 4組大鼠腦組織神經元形態

3 TSPN 對大鼠血清中NO、IL-6 和IL-1β 水平的影響

與對照組相比，模型組和TSPN+抑制劑組血清中NO、IL-6 和IL-1β 水平，以及TSPN 組血清中NO 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，TSPN 組血清中NO、IL-6 和IL-1β 水平，以及TSPN+抑制劑組血清中IL-6 和IL-1β 水平顯著降低（P＜0.05）；與TSPN 組相比，TSPN+抑制劑組血清中NO、IL-6 和IL-1β 水平顯著升高（P＜0.05），見圖4。

Figure 4. The levels of NO，IL-6 and IL-1β in serum of the rats in the 4 groups were compared. A：NO level in serum；B：IL-6 level in serum；C：IL-1β level in serum. Mean±SD.n=12.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs model group；＆amp;P＜0.05vs TSPN group.圖4 4組大鼠血清中NO、IL-6和IL-1β水平比較

4 TSPN 對大鼠腦組織中5-HT、β-EP 和CGRP 含量的影響

與對照組相比，模型組腦組織中5-HT和β-EP含量，以及TSPN+抑制劑組腦組織中5-HT 含量顯著降低（P＜0.05），TSPN 組腦組織中β-EP 含量，以及模型組、TSPN 組和TSPN+抑制劑組腦組織中CGRP 含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，TSPN 組腦組織中5-HT和β-EP含量，以及TSPN+抑制劑組腦組織中β-EP 含量顯著升高（P＜0.05），TSPN 組和TSPN+抑制劑組腦組織中CGRP 含量顯著降低（P＜0.05）；與TSPN 組相比，TSPN+抑制劑組腦組織中5-HT 和β-EP含量顯著降低（P＜0.05），CGRP含量顯著升高（P＜0.05），見圖5。

Figure 5. Comparison of the contents of 5-HT，β-EP and CGRP in brain tissues of the rats in the 4 groups. A：5-HT content in brain tissue；B：β-EP content in brain tissue；C：CGRP content in brain tissue. Mean±SD.n=6*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs model group；＆amp;P＜0.05vs TSPN group.圖5 4組大鼠腦組織中5-HT、β-EP和CGRP含量比較

5 TSPN 對大鼠腦組織中NRG1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、caspase-3 和cleaved caspase-3 蛋白表達的影響

與對照組相比，模型組和TSPN+抑制劑組腦組織中NRG1、ErbB2、ErbB3 和ErbB4 蛋白水平，以及TSPN 組腦組織中ErbB2、ErbB3 和ErbB4 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），模型組和TSPN+抑制劑組腦組織中cleaved caspase-3/caspase-3蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，TSPN 組腦組織中NRG1、ErbB2、ErbB3 和ErbB4 蛋白水平，以及TSPN+抑制劑組腦組織中NRG1 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），TSPN 組和TSPN+抑制劑組腦組織中cleaved caspase-3/caspase-3 蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與TSPN 組相比，TSPN+抑制劑組腦組織中NRG1、ErbB2、ErbB3和ErbB4 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），cleaved caspase-3/caspase-3 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見圖6。

Figure 6. The protein levels of NRG1，ErbB2，ErbB3，ErbB4，caspase-3 and cleaved caspase-3 in brain tissues of the rats in the 4 groups. Mean±SD.n=6.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs model group；＆amp;P＜0.05vs TSPN group.圖6 4組大鼠腦組織中NRG1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、caspase-3和cleaved caspase-3蛋白水平情況

討論

偏頭痛中醫屬“頭風”、“頭痛”、“厥頭痛”等范疇，表現為感受外邪、情至內傷、飲食不節、久病至淤所致肝、脾、腎失常，導致痰淤阻絡［9］。本研究中，偏頭痛大鼠出現耳紅、爬籠、撓頭、咬尾、往返運動增加，提示大鼠出現不適癥狀。TSPN 在神經保護方面研究成為熱點，可緩解神經元損傷［10］，在麻醉藥七氟醚致神經元損害中，TSPN 可促進細胞增殖、抑制細胞凋亡進而緩解七氟醚導致的神經細胞凋亡、學習和記憶障礙現象，實現對機體的保護［11］。TSPN 治療偏頭痛后大鼠耳紅、爬籠、撓頭、咬尾、往返運動癥狀均有所減輕，耳紅出現時間延后、耳紅消退時間提前，提示TSPN 能夠緩解偏頭痛造成的不適癥狀。HE 染色檢測，偏頭痛大鼠腦組織出現明顯的神經元壞死、空泡現象；經TSPN 治療后，腦組織神經元損傷現象得到一定緩解，提示TSPN 可能緩解神經元損傷實現對偏頭痛大鼠的保護。

在本研究用硝酸甘油誘導大鼠制備偏頭痛模型，硝酸甘油作為NO 供體，在體內可直接作用于血管平滑肌細胞生成NO，增加血液中NO 含量［12］；硝酸甘油也可刺激神經末梢釋放CGRP，CGRP 在外周血中濃度增加會誘發血管擴張和腦膜肥大細胞脫顆粒，進而釋放神經組織血管活性物質，包括IL-6 和IL-1β等，誘發神經源性炎癥偏頭痛［13］。5-HT在偏頭痛發作期水平降低，可引起血管擴張性疼痛，臨床上多種頭痛藥通過激活5-HT 發揮作用［14］。β-EP 在疼痛應激下可釋放入血，抑制P 物質的釋放，從而使神經疼痛感覺抑制［15］。本研究顯示，模型組血清中NO、IL-6 和IL-1β 水平，以及腦組織中CGRP 含量升高，腦組織中5-HT和β-EP含量降低。這提示大鼠受硝酸甘油刺激，生成NO，增加血液中NO 含量；同時刺激CGRP 的生成，CGRP 水平升高誘發血管擴張和腦膜肥大細胞脫顆粒，促進IL-6 和IL-1β 的升高，誘發炎癥偏頭痛；偏頭痛發生后神經遞質5-HT和β-EP含量降低，增加痛感，導致大鼠出現不適癥狀。經TSPN 治療后，血清中NO、IL-6 和IL-1β 水平，以及腦組織中CGRP 含量降低，腦組織中5-HT 和β-EP 含量升高，提示TSPN 能夠緩解硝酸甘油造成的大鼠炎癥性偏頭痛，減少大鼠痛感，實現對疾病的保護。

NRG 可作為配體結合于細胞表面ErbB 受體，引起原有構象發生改變，進而影響下游信號通路的變化，進而調節神經細胞［16］。NRG 中NRG1 研究較廣泛，ErbB 在腦中神經元胞體中可見ErbB2、ErbB3 和ErbB4。另有研究顯示，NRG/ErbB 通路具有抗凋亡作用，能夠抑制caspase-3的活化，實現對神經干細胞凋亡的緩解［17］；能夠抑制巨噬細胞的浸潤，阻斷巨噬細胞和小膠質細胞表達促炎因子［18］。在本研究中，模型組NRG1、ErbB2、ErbB3和ErbB4蛋白水平降低，cleaved caspase-3/caspase-3 蛋白水平升高，提示NRG/ErbB 通路蛋白在偏頭痛腦組織中表達降低，對神經元的保護作用減弱，導致炎癥損傷加劇、神經元凋亡嚴重。經TSPN 治療后，NRG/ErbB 通路處于激活狀態，cleaved caspase-3/caspase-3 蛋白水平降低；在TSPN 治療基礎上添加抑制劑AG825，雖然AG825作為ErbB2 的特異性抑制劑，但ErbB2 受NRG 刺激發揮作用，會促進cleaved caspase-3/caspase-3、炎癥因子IL-6 和IL-1β 水平升高，提示TSPN 能夠通過激活NRG/ErbB通路實現對炎癥、細胞凋亡的緩解。

綜上所述，TSPN 通過激活NRG/ErbB 通路實現對偏頭痛大鼠的保護，可能與抑制炎癥、抑制神經元凋亡有關，為TSPN 在臨床上治療偏頭痛提供一定動物實驗參考依據。