線粒體功能障礙在細胞衰老中作用的研究進展*

朱夢琪， 閔賽南， 吳立玲， 俞光巖， 叢 馨△

（1北京大學口腔醫學院口腔頜面外科，北京100081；2北京大學基礎醫學院生理學與病理生理學系，北京100191）

細胞衰老（cellular senescence）是指細胞不可逆性喪失復制能力，細胞周期阻滯于G0/G1期，但細胞仍保持一定的代謝活性。衰老細胞的累積會導致器官功能障礙，與多種衰老相關性疾病（aging-related disease，ARD）的發生發展密切相關，如特發性肺纖維化［1］、動脈粥樣硬化［2］、阿爾茨海默病［3］等，嚴重影響患者的生活質量。因此，深入認識細胞衰老的發生原因和分子機制對于早期干預及治療ARD 具有重要意義。線粒體是細胞的“能量工廠”，線粒體功能障礙亦是引起細胞衰老的重要原因。傳統的觀點認為線粒體功能紊亂主要通過氧化應激導致細胞周期阻滯，包括線粒體來源的活性氧（reactive oxygen species，ROS）對線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）、線粒體膜和端粒的損傷作用等，從而造成細胞衰老。近年來的研究發現，以線粒體動力學、能量代謝和質量控制等異常為特征的線粒體穩態調控失常在細胞衰老中發揮重要作用。本文旨在綜述線粒體功能障礙在細胞衰老中的作用及機制研究的新進展，為以線粒體為靶點防治細胞衰老提供新思路。

1 概述

細胞衰老可分為復制性衰老（replicative senescence，RS）和應激誘導性早衰（stress-induced premature senescence，SIPS）兩大類：前者是指細胞經過有限的分裂次數后染色體末端的端粒逐漸縮短，由此出現的細胞增殖停滯和分化能力喪失等衰老特征；后者是指在癌基因激活、DNA 損傷和氧化應激等病理刺激下，細胞發生的過早衰老。早期的研究認為，SIPS 的發生獨立于端粒狀態，然而越來越多的證據表明它同樣可與端粒的縮短和功能障礙有關［4-5］。這2種類型的衰老有許多共同的調控分子，如均主要通過p53/p21 和（或）p16/視網膜母細胞瘤（retinoblastoma，Rb）蛋白信號通路引起細胞周期阻滯［6］。細胞發生衰老后可伴隨一系列的表型改變，包括在形態上變得扁平、體積增大，在蛋白表達調控上表現為細胞周期蛋白激酶抑制分子如p53、p21 和p16 等表達增加以及衰老相關β-半乳糖苷酶活性增強等；衰老細胞還表現出一定的抗凋亡特性，這可能是衰老細胞失去增殖能力后卻能長期存活的重要原因。此外，衰老細胞的一個重要特征是發生衰老相關分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）轉化，繼而分泌更多的促炎因子、生長因子和趨化因子等，以自分泌和旁分泌的方式引起局部炎癥反應，進一步加速其鄰近細胞的衰老。

線粒體是一種廣泛存在于真核細胞中的細胞器，不僅可通過氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）產生ATP，為細胞提供能量，還在細胞分化、信息傳遞和凋亡等過程中發揮重要作用［7］。線粒體穩態是機體維持線粒體和細胞正常功能的重要機制，主要包括線粒體動力學（mitochondrial dynamics）、線粒體生物生成（mitochondrial biogenesis）和線粒體自噬（mitophagy）等調控過程。近年來研究報道，由線粒體穩態失衡所致的形態和功能異常的線粒體可見于多種衰老細胞中，而通過誘導線粒體自噬來清除受損線粒體可有效緩解細胞衰老的發生，這提示線粒體形態和功能異常可能參與了細胞衰老的發生發展。

2 衰老細胞中線粒體形態的改變

線粒體的結構由內向外可劃分為基質、內膜、膜間隙和外膜4個部分。其中，線粒體內膜向內皺褶形成管狀或片狀的內陷，稱為線粒體嵴，嵴上含有大量ATP 合酶，與調控線粒體呼吸功能關系密切。另外，線粒體的形態呈現一定程度的組織特異性，如在肝細胞中呈球形或卵圓形，而在成纖維細胞中通常是長絲狀［8］。衰老細胞的線粒體結構和形態會發生異常改變：在發生RS 的人成纖維細胞誘導的多能干細胞中觀察到線粒體嵴斷裂［9］；在慢性阻塞性肺疾病患者衰老的支氣管上皮細胞中存在線粒體腫脹和分裂現象，且碎片化程度顯著高于正常細胞［10］；在去鐵胺誘導的人衰老肝細胞中發現線粒體腫脹和長度增加［11］；在替莫唑胺誘導的小鼠衰老黑色素瘤細胞中堆積著細長的管狀線粒體，其長度較正常短圓形線粒體顯著增加［12］。此外，線粒體在衰老細胞中的分布也會發生改變：線粒體在正常豬卵母細胞中均勻分布于細胞漿中，而在體外培養的RS 細胞中則成簇地聚集于細胞漿或胞膜內側［13］。上述研究表明，衰老細胞中存在結構、形態和分布異常的線粒體，它們是否參與細胞衰老的發生也是目前研究的關注點。

3 細胞衰老與線粒體動力學改變

線粒體是一種動態變化的細胞器，在細胞內形成相互連接的網絡并沿著細胞骨架運動，通過不斷融合和分裂來改變自身形態，以適應細胞對能量需求的變化，這一過程稱為線粒體動力學。在哺乳動物中，研究較多的調控融合的蛋白是線粒體融合蛋白1/2（mitofusion 1/2，MFN1/2）和視神經萎縮癥蛋白1（optic atrophy 1，OPA1）［14］。MFN1/2 是位于線粒體外膜的跨膜蛋白，參與調控線粒體外膜的融合；OPA1表達于線粒體膜間隙內，不僅可以介導內膜的融合，還能夠維持線粒體嵴結構和內膜的完整性。調控線粒體分裂的主要分子包括發動蛋白相關蛋白1（dynamin-related protein 1，DRP1）、線粒體分裂因子（mitochondrial fission factor，MFF）和線粒體分裂蛋白1（mitochondrial fission protein 1，FIS1）［15］。其中，DRP1主要表達在胞漿。在受到特定刺激后，位于線粒體表面的MFF和FIS1可招募DRP1至線粒體周圍，聚集的DRP1呈螺旋環狀包繞線粒體并形成裂變點，從而將線粒體受損部分與正常部分分離，并通過線粒體自噬清除受損部分以維持線粒體的正常功能［16-17］。

正常情況下，線粒體的融合和分裂處于動態平衡狀態，一旦被打破，線粒體形態可發生改變并進一步導致功能障礙。在發生RS 的人骨髓間充質干細胞中存在線粒體融合增加及分裂減少的現象［18］。在人肝細胞中敲減膜相關鋅指蛋白5 可減少DRP1 的表達，增加MFN1 的表達，引起線粒體融合和長度增加，從而導致細胞發生衰老［19］。在敲減FIS1的人肝細胞中可見線粒體長度增加、細胞變大變平、衰老相關β-半乳糖苷酶活性升高和細胞增殖能力顯著降低等細胞衰老特征［20］。在人肺癌細胞中過表達p53 蛋白能夠增加DRP1 第637 位絲氨酸的磷酸化，抑制DRP1 向線粒體移動，引起線粒體變長及功能障礙，從而導致細胞衰老［21］。上述研究提示，線粒體的過度融合是導致細胞衰老的一個重要原因。通常認為，融合能夠增加ATP 的生成，是線粒體對細胞能量需求增加和線粒體生物生成減少的應對措施［22］，也有觀點認為線粒體融合會導致ROS增加及線粒體呼吸功能降低［11］，但其具體機制仍需進一步探究。

此外，線粒體的過度分裂也可導致細胞衰老。有研究發現，蛋白質二硫化異構酶A1 的低表達可誘導DRP1 發生亞磺酰化，引起線粒體分裂，從而導致人臍靜脈內皮細胞發生衰老［23］。在人血管平滑肌細胞中，敲減轉錄因子Krüppel 樣因子5 可降低真核細胞翻譯起始因子5a 的表達，引起線粒體過度分裂和ROS 產生，導致細胞衰老［24］。然而，也有觀點認為線粒體異常分裂只是細胞衰老的結果。

以上研究表明，線粒體動力學的變化將導致線粒體的形態改變和功能障礙，從而造成細胞衰老。其中，線粒體的過度融合導致細胞衰老的現象較為明確，而線粒體的過度分裂與細胞衰老的因果關系仍需進一步研究。

4 線粒體能量代謝對細胞衰老的影響

線粒體能量代謝異常與細胞衰老的發生密切相關［25-26］。正常情況下，細胞內絕大部分的ATP由線粒體內膜上的OXPHOS 產生，這一過程需要由呼吸鏈復合物I～IV 構成的電子傳遞鏈和ATP 合酶的參與［27-28］。線粒體氧化損傷和mtDNA 突變等因素可通過損傷呼吸鏈復合物引起線粒體能量代謝障礙，導致細胞衰老。有學者檢測了中青年（29～62 歲）及老年（65～83 歲）心肌細胞OXPHOS 相關分子表達及活性的變化，發現老年組有10%的線粒體蛋白編碼基因表達發生顯著變化，其中49%與線粒體能量代謝相關，提示線粒體能量代謝的改變可能與人心肌細胞的衰老有關［29］。在衰老的人成纖維細胞中，線粒體OXPHOS 相關基因表達下降，且伴有明顯的線粒體功能障礙，通過誘導線粒體自噬以清除受損線粒體的方法可有效地減少衰老細胞發生SASP 轉化［30］。線粒體電子傳遞鏈抑制劑魚藤酮可通過抑制呼吸鏈復合物I 的活性，誘導年輕小鼠肝細胞發生衰老［31］。最近，有研究發現抑制呼吸鏈復合物I活性可導致人成纖維細胞線粒體功能障礙，并引起一種特殊類型的細胞衰老，稱為線粒體功能障礙相關性衰老（mitochondrial dysfunction-associated senescence，MiDAS）。與相同細胞類型的RS 相比，MiDAS 細胞表現為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）值降低、AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）和p53 蛋白磷酸化以及SASP相關因子如IL-1 的表達明顯減少［32］。在體外培養的小鼠骨髓間充質干細胞中，C1q/腫瘤壞死因子相關蛋白9 能夠激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1α，PGC-1α）/AMPK 信號通路，增強細胞的抗氧化能力；而沉默PGC-1α或AMPK基因會造成細胞內ROS 水平升高，引起線粒體呼吸能力下降，ATP 生成減少，進而導致細胞衰老［33］。以上研究提示，呼吸鏈功能損傷引起的線粒體能量代謝障礙是細胞衰老的重要原因。

此外，呼吸鏈復合物I 可將NADH 氧化為NAD+，NAD+作為傳遞電子的輔酶在ATP 合成過程中發揮重要的作用。近年來，越來越多的研究證實NAD+在抑制細胞和機體衰老過程中亦發揮重要作用。在小鼠視網膜色素細胞中，NAD+的表達水平與年齡呈負相關［34］。有學者分析了15 位青年人［（29±4）歲］和15位老年人［（81±7）歲］的血液代謝物，發現NAD+的表達水平隨年齡的增長而降低［35］。進一步探究其機制，NAD+表達水平的降低可減少超氧化物歧化酶的表達，進而增加細胞內ROS的水平，從而誘導體外培養的大鼠心肌細胞發生衰老［36］。此外，NAD+表達水平的下降可抑制NAD+依賴性蛋白——沉默信息調節因子1（silent information regulator 1，SIRT1）的活性，促進人成纖維細胞的衰老，而上調NAD+的表達水平可顯著抑制細胞衰老［37］。此外，在衰老的人胚肺成纖維細胞中，NAD+可通過增強NF-κB 的活性，上調SASP 相關分子IL-1β、IL-6 和IL-8 的表達，從而促進腫瘤細胞增殖，提示盡管NAD+具有一定的抗衰老作用，但對于腫瘤患者給予含NAD+的抗衰老飲食時仍應控制劑量［38］。以上結果表明，線粒體能量代謝異常可導致細胞衰老；更加全面地了解NAD+的抗衰老和其他副作用，將是后續研究的重點。

5 線粒體質量控制對細胞衰老的影響

線粒體質量控制是維持線粒體功能的一個重要因素，主要包括線粒體生物生成和受損線粒體的生物降解。線粒體的生物生成包括嚴格調控的轉錄、mtDNA 復制、脂質和蛋白質的合成和組裝等過程［39］。PGC-1α 是目前研究較多的一個調控線粒體生物生成的重要分子，主要分布于心肌、骨骼肌等能量需求較高的組織中。PGC-1α通過誘導核呼吸因子1的表達激活線粒體轉錄因子A 以促進mtDNA 的轉錄，從而增加線粒體生物生成，若PGC-1α 表達水平降低則可導致線粒體生物合成障礙［40-41］。在端粒功能障礙的小鼠中，活化的p53 可降低PGC-1α/β 表達，抑制mtDNA 轉錄，減少線粒體生物生成，最終引起心肌和肝細胞衰老［42］。此外，敲減小鼠胚胎成纖維細胞中PGC-1α 的表達，還可引起線粒體ROS 水平增加，導致細胞衰老的發生［43］。血管內皮細胞衰老是許多衰老相關心血管疾病如高血壓和動脈粥樣硬化的發病原因。有研究發現，敲減CR6 相互作用因子1 可促進核因子E2 相關因子2 和PGC-1α 降解，下調SIRT3的表達，導致血管內皮細胞發生衰老［44］。除了表達水平的變化，PGC-1α 表觀遺傳的修飾變化如乙酰化水平也會誘導細胞衰老。有研究發現，大鼠衰老心肌細胞中線粒體基質密度降低，線粒體嵴紊亂，內膜損傷；腹腔注射亞精胺可通過上調心肌細胞內NAD+的表達進而促進SIRT1 介導的PGC-1α 去乙酰化，從而增加線粒體生物生成，減緩心肌衰老程度，而敲減PGC-1α則可阻斷上述作用［45］。在人腦微血管內皮細胞中，敲減PGC-1α能夠減少ATP 生成并引起細胞衰老；而在放射誘導的衰老細胞中，組蛋白脫乙酰酶的表達水平顯著下降，導致PGC-1α 的乙酰化水平上升，這可能是此時細胞衰老發生的機制之一［46］。以上研究提示，PGC-1α 可通過調節線粒體生物生成和ROS 水平等在決定細胞衰老過程中發揮重要作用，因此以調節PGC-1α 表達和表觀遺傳為靶點的抗衰老策略，可能在ARD治療中具有潛在的應用前景。

除了生物生成，降解對于控制線粒體的質量同樣重要。線粒體自噬作為一種選擇性自噬類型，可特異性降解細胞內受損或多余的線粒體［47］。哺乳動物線粒體自噬的一般過程為：線粒體表面的PTEN誘導假定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）招募parkin 蛋白及其他因子至線粒體外膜，將受損線粒體分離出來；parkin蛋白繼而招募泛素結合因子p62，p62 可與錨定于自噬囊泡膜上的微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）結合，形成自噬小體并包裹受損的線粒體片段，再與溶酶體融合形成自噬溶酶體，從而將線粒體片段降解［48］。此外，還有獨立于PINK1-parkin 的線粒體自噬受體，如含FUN14結構域蛋白1、Bcl-2/腺病毒E1B 19 kD 相互作用蛋白3（Bcl-2/adenovirus E1B 19 kD-interacting protein 3，BNIP3）和BNIP3 樣蛋白（BNIP3-like protein，BNIP3L/NIX）等［49］。線粒體自噬相關蛋白表達的改變可影響損傷線粒體的降解，與細胞衰老密切相關。有研究表明，衰老小鼠的脛骨前肌細胞中線粒體自噬和生物生成能力下降，功能受損的線粒體大量累積［50］。在過氧化氫誘導的人衰老髓核細胞中，上調PINK1 蛋白的表達可促進線粒體自噬，從而減少功能受損線粒體的累積，抑制細胞衰老的發生［51］。高糖培養可導致小鼠腎小管上皮細胞發生衰老，其機制與高糖降低PINK1 蛋白和視神經蛋白的表達進而抑制線粒體自噬水平有關［52］。血紅素加氧酶1能夠促進parkin蛋白與線粒體結合，誘導受損線粒體發生自噬，抑制髓核細胞的衰老，從而延緩家兔椎間盤的退變［53］。槲皮苷可通過激活SIRT1/PINK1/parkin 通路，促進線粒體自噬，從而抑制大鼠腎小管上皮細胞衰老［54］。此外，通過誘導線粒體自噬、清除受損的線粒體還可有效阻斷人衰老成纖維細胞的SASP轉化［55］。

以上結果表明，線粒體生物生成和降解的動態平衡對保障線粒體的質量至關重要；生物生成和（或）降解的減少均可引起細胞衰老，線粒體質量控制是值得關注的抗衰老作用靶點。

6 靶向線粒體的抗細胞衰老策略

基于線粒體功能在細胞衰老中的重要作用，開拓以線粒體為靶點的改善細胞衰老的方法逐漸受到人們的關注。但目前已知的抗細胞衰老藥物均主要針對清除ROS和降低氧化應激損傷等經典機制。有研究發現，褪黑素能夠降低衰老間充質干細胞的ROS 水平，提高線粒體膜電位，促進損傷線粒體發生自噬，從而抑制細胞衰老的發生發展，而衰老間充質干細胞經褪黑素處理后能夠通過抑制細胞凋亡、誘導細胞增殖和血管新生，進一步促進小鼠缺血下肢的功能恢復［56］。MitoQ 是一種靶向線粒體的抗氧化劑，能夠特異性清除線粒體ROS。在阿爾茨海默病小鼠模型中，MitoQ 可減輕腦組織的氧化應激并減少β-淀粉樣蛋白的表達，從而提高老年小鼠的認知能力，且MitoQ 還可以顯著延長小鼠的壽命，這提示靶向清除線粒體ROS是治療阿爾茨海默病的一種潛在有效方法［57］。另一種靶向線粒體的抗氧化劑SKQ1可通過抑制視網膜細胞中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的活性來抑制細胞衰老，從而減輕大鼠老年性黃斑變性癥狀的嚴重程度［58］。

線粒體治療（mitotherapy）是指將外源性的正常線粒體移植到線粒體功能障礙的細胞中，以恢復細胞活力。最近的一項研究發現，將年輕小鼠肝臟內功能正常的線粒體通過尾靜脈注射至衰老小鼠體內，這些線粒體可進入并穩定存在于衰老小鼠的腦、骨骼肌、肝、腎、心和肺組織中，尤其是富含線粒體的腦和骨骼肌細胞。更重要的是這些年輕線粒體可發揮作用，顯著提高腦和骨骼肌細胞內線粒體呼吸相關酶的表達并降低ROS水平，改善衰老小鼠的學習、記憶和運動功能［59］。以上研究提示，恢復衰老細胞的線粒體功能，有望成為預防和治療細胞衰老的有效策略。

7 結語與展望

近年來的研究逐步深入地揭示了線粒體功能障礙引起細胞衰老的多種機制，包括動力學改變、能量代謝障礙、質量控制失衡等，為以調控線粒體穩態為目標防治細胞衰老的策略提供了有力證據。然而這些機制在不同原因、不同類型細胞衰老中的作用以及是否通過協同作用促進細胞衰老，仍有待進一步探討。目前，靶向清除線粒體內ROS 的療法表現出一定的抗細胞衰老效果，但仍需進行以線粒體相關機制為靶點的藥物研發，以及提升抗細胞衰老的效果。相信隨著衰老細胞檢測方法和線粒體檢測技術的不斷發展，關于線粒體功能障礙在多種類型細胞衰老中作用的認識會更加清晰，這將為以線粒體為靶點而精準治療ARD提供科學依據和新思路。