PINK1/parkin信號通路介導的線粒體自噬在心力衰竭中的作用*

吳雁澤， 熊文俊

（1南昌大學，江西南昌 330006；2江西省高血壓研究所，南昌大學第一附屬醫院心血管內科，江西南昌 330006）

心力衰竭（heart failure，HF）簡稱心衰，是心臟功能發生障礙導致心室泵血功能受損引起的循環障礙癥候群。心衰是各種心血管病程的終末期階段，具有發病率高、住院率高和死亡率高的特點［1］。隨著人口老齡化加快，各種常見心血管病發病率增高，心衰的患病率也在逐漸上升。目前，我國35 歲以上的成年人心衰的患病率為1.3%，較2000 年增加了44%［2］。因此，理解心衰的發病機制對治療心衰有重要意義。心肌高度依賴能量，線粒體通過氧化磷酸化過程產生心臟的主要能源物質三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），因此被成為心肌細胞的“能量供應站”［3］。研究表明線粒體自噬（mitophagy）與心衰有密切聯系，而PTEN 誘導假定激酶1（PTENinduced putative kinase 1，PINK1）/parkin 信號通路介導的線粒體自噬作為主要的通路之一對維持心肌細胞能量代謝發揮重要作用［4］。心衰時，心肌內細胞線粒體發生損傷，作為線粒體質量控制系統“哨兵”的PINK1 在線粒體外膜累積，募集并磷酸化parkin。激活的parkin 泛素化受損的線粒體，隨后受損線粒體與溶酶體融合完成降解。Shires 等［5］發現，增強PINK1/parkin 信號通路介導的線粒體自噬可以維持心肌細胞線粒體穩態和減緩心衰的進程。因此深入研究PINK1/parkin 信號通路介導的線粒體自噬對靶向線粒體治療心衰有重要意義。

1 線粒體自噬與心力衰竭

1.1 線粒體自噬 線粒體在氧化磷酸化過程中會伴隨活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產生，因此線粒體高度暴露于氧化應激損傷［6］。正常生理狀態下，ROS 可以作為細胞內信號分子，通過氧化還原反應激活氧化還原信號分子，并參與調控細胞內信號傳導［7］。過度積累的ROS 會攻擊蛋白質和核苷酸，由于線粒體DNA 比核DNA 更容易突變，線粒體更容易受到損傷［8］。受損的線粒體產生的ROS是健康線粒體的10 倍以上，大量累積的ROS 可損傷線粒體，加重線粒體功能障礙，因此及時清除受損的線粒體對維護細胞穩態有重要作用［9］。

Lemasters［8］最早提出“線粒體自噬”，并表明線粒體自噬是通過細胞自噬靶向清除體內功能異常的線粒體的過程，具有選擇性。線粒體自噬與線粒體的融合分裂密切相關［10］。線粒體并不是孤立的，它們之間形成了高度動態的網絡，根據細胞代謝需求，通過線粒體動力學（融合和分裂）來調整線粒體網絡結構。線粒體分裂是線粒體自噬的先決條件，細長的線粒體通過分裂成為易于包裹的片段，而后線粒體自噬可以選擇性分離并降解受損的線粒體物質［11］。有相關研究者提出了線粒體自噬的“兩步模型”［12］：第一步是受損的線粒體被parkin 泛素化后與自噬相關基因（autophagy-related gene，ATG）上游蛋白在自噬小體形成位點聚集。該過程不依賴自噬微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3），也不形成隔離膜。第二步是受損線粒體和上游ATGs進行聯系，形成隔離膜包裹損傷的線粒體，然后整合到自噬小體中，并與溶酶體融合，最終降解受損線粒體。這一過程需要LC3 以及連接線粒體與LC3 的銜接蛋白p62、NBR1（neighbor ofBRCA1gene 1）和OPTN（optineurin）參與。通過線粒體自噬的選擇性降解受損的線粒體，在維持能量穩態和減少ROS的產生具有重要作用［13］。

目前提出的線粒體自噬機制分為兩種：泛素依賴型和非泛素依賴型。泛素依賴型線粒體自噬包括PINK1/parkin 信號通路介導的線粒體自噬和非parkin 依賴型線粒體自噬；而非泛素依賴型線粒體自噬則是直接由線粒體自噬受體介導的線粒體自噬［9，14］。其中最受廣泛研究的是PINK1/parkin 介導的調控途徑。PINK1/parkin 信號通路介導線粒體自噬是指在受損線粒體中，PINK1 聚集于線粒體外膜，募集parkin 至線粒體磷酸化，并進一步介導與LC3 的結合，降解受損的線粒體，這一過程依賴parkin 的存在。而非parkin依賴型通路，可以通過除parkin以外的其他E3 泛素連接酶，如SIAH1（seven in absentia homolog-1）、ARIH1（ariadne homolog-1）將線粒體外膜底物蛋白泛素化，而后與LC3結合進入自噬體［15-16］。此外，PINK1 也可直接磷酸-泛素化線粒體外膜自噬受體并誘導線粒體自噬［17］。非泛素依賴型線粒體自噬主要通過在線粒體膜表達自噬受體蛋白，如Nip3 樣蛋白X（Nip3-like protein X，NIX）、BCL2/腺病毒E1B 19 kD 相互作用蛋白3（BCL2/adenovirus E1B 19 kDinteracting protein 3，BNIP3）和含FUN14 結構域蛋白1（FUN14 domain-containing protein 1，FUNDC1）介導LC3的招募，使自噬體能吞噬受損線粒體［18］。

線粒體內穩態是細胞生存的基礎。線粒體對心肌功能的重要性遠遠強于對其他非肌肉組織，通過小分子選擇性激活心肌細胞內特異性線粒體自噬通路而維持線粒體穩態對心肌具有保護作用。目前，沒有可用的分子干預手段允許對哺乳動物的心肌細胞自噬進行純粹的特異性修飾［19］。近年來的諸多研究亦表明哺乳動物細胞線粒體自噬途徑在體內組織普遍存在［20-23］。而心肌內特異性線粒體自噬通路有待進一步研究發現，尋找心肌特異性通路靶向治療心肌病將是線粒體自噬的下一個前沿領域。

1.2 線粒體自噬在心力衰竭中的作用 線粒體約占心肌細胞體積的30%～40%，線粒體狀態與心肌細胞功能聯系緊密［24］。線粒體功能障礙是心衰發病機制中一個重要的病理生理學特征。正常情況下，線粒體自噬對心肌細胞具有保護作用，心衰時上調線粒體自噬可以維持心肌細胞穩態和心臟的功能，而線粒體自噬不足會加重心衰的發展［9］。然而，線粒體自噬在疾病中的作用仍存在爭議。在病程早期，激活線粒體自噬降解非健康線粒體以防止受損線粒體引起細胞內環境紊亂，對機體有益；而在病程晚期，大量受損線粒體被降解，導致線粒體質量和數量急劇下降，引起嚴重的能量損耗，加重細胞損傷，最終誘導細胞啟動死亡程序。Liu 等［25］在研究中發現異丙腎上腺素可激活自噬而誘導大鼠心肌肥大，而姜黃素則通過降低beclin-1的表達抑制自噬，從而減輕由異丙腎上腺素誘導的心肌肥大。在壓力負荷誘導的心肌肥大發病機制中，心肌細胞自噬是必要條件，且心肌細胞自噬是心肌重塑的標志性特征之一。心肌細胞自噬途徑在細胞穩態中降解非正常細胞器和異常蛋白質，而過多自噬通量的激活靶向過度消耗關鍵因子，從而促進疾病發展。自噬相關基因Atg5缺陷的小鼠由于不能誘導心肌細胞自噬會導致泛素化蛋白質累積、應激增加和心肌細胞的凋亡，最終導致心衰的發生發展［26］。MSTN基因（編碼myostatin）敲除的小鼠對心肌肥大刺激更敏感，并發展為更嚴重的病理性心肌肥大；而過表達MSTN可以通過阻斷AMPK/mTOR 和miR-128/PPARγ/NF-κB 信號通路抑制心肌過度自噬，從而減輕心肌肥大效應［27］。事實上，自噬發揮的綜合效應取決于病程所處的階段，自噬活動在不同階段執行不同的生物學效應，因而需要更多的研究來充分了解自噬的調控機制。

心臟應激適度誘導線粒體自噬有助于清除受損和功能失調的線粒體，可以防止細胞凋亡的啟動而最終導致的心衰氧化損傷［28］。心衰條件下線粒體自噬的上調是一種保護心臟免受血液動力學應激的適應性反應［29］。Wang 等［30］在主動脈弓縮窄（transverse aortic constriction，TAC）誘導的小鼠衰竭心臟模型中觀察到AMP 活化蛋白激酶α2（AMP-activated protein kinase α2，AMPKα2）在小鼠心臟中過度表達可以增強線粒體自噬，促進線粒體功能，并且阻止TAC 誘導心衰的發展。當自噬被抑制時，心臟功能障礙加重，并且增加了對缺血再灌注損傷的敏感性。Zhou等［31］發現，抑制FUNDC1 依賴性線粒體自噬破壞了線粒體穩態并促進了缺血再灌注損傷的發展。事實上，心肌細胞自噬增強是把雙刃劍，既可保護心肌細胞，又可加重心衰［6］。長期或高水平的心臟應激可引起心肌細胞內線粒體的損傷和功能障礙，從而加重心衰。Givvmani 等［32］發現，在升主動脈結扎誘導的心衰模型中，持續的超負荷應激可導致線粒體自噬過度增強，引起細胞異常凋亡；用線粒體自噬抑制劑處理后，心功能得到改善。因此，適當誘導或抑制心肌線粒體自噬的策略對于心衰的治療至關重要。

2 PINK1/parkin介導的線粒體自噬與心力衰竭

眾所周知，在線粒體自噬途徑研究中，PINK1/parkin 介導的自噬是最受廣泛關注的。Kitada 等［33］報道，編碼PINK1 和parkin 的兩個基因突變會導致常染色體隱性遺傳早發性帕金森病。后來的研究表明，這兩種蛋白質是細胞器質量控制系統的重要成分，有助于維持細胞中線粒體的正常功能［34］。突變的PINK1 被證明與線粒體功能障礙有關［35］。正常的PINK1 和E3 泛素連接酶parkin 存在直接的功能聯系，PINK1 是parkin 的上游蛋白，可以募集parkin 而發揮功能［36］。然而，也有研究證明在心肌細胞敲除PINK1后，parkin 仍然能夠被募集并激活，但parkin的易位和激活會延遲，說明除了PINK1 外，還存在其他能夠激活parkin從而激活線粒體自噬的通路［37］。

2.1 PINK1/parkin 介導的線粒體自噬 PINK1 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，由581個氨基酸組成，包含由34 個氨基酸組成的N 端線粒體靶向序列、一個α 螺旋跨膜片段和一個高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域。編碼PINK1的基因PARK6在細胞中普遍表達，但在正常細胞中通常無法被檢測到［38］。PINK1轉位至線粒體內膜依賴線粒體膜電位的正常［38］。在正常線粒體中，線粒體膜電位水平較高，PINK1 通過外膜轉位酶（translocase of the outermembrane）轉入線粒體內，被早老素相關菱形樣蛋白（presenilin-associated rhomboid-like protein，PARL）所酶解，隨后被釋放到細胞質中，與其中的parkin 相互作用并抑制parkin 向線粒體外膜轉位［39］。當線粒體功能發生障礙時，線粒體膜電位降低，PINK1 聚集在外膜上進行自身磷酸化，并募集具有E3 連接酶活性的parkin 到線粒體外膜將其磷酸化。PINK1 通過N 端線粒體靶向序列感知線粒體膜電位，可作為正常線粒體的活性指標，也成為受損線粒體的“感受器”。

parkin是由PARK2基因編碼的一種E3泛素連接酶，由465個氨基酸組成，其包含N 端泛素樣（ubiquitin-like，UBL）結構域、RING0、RING1 和RING2 以及分隔RING1 和RING2 的環間結構域（in-between-RING，IBR）［40］。parkin 在腦、心臟和骨骼肌組織中顯著表達，提示parkin 表達具有廣泛生理意義。一般情況下，parkin 位于細胞質中，其泛素連接酶活性受到抑制。在細胞應激后，PINK1募集parkin至受損線粒體并磷酸化激活parkin。磷酸化的parkin 將線粒體膜上的底物蛋白［如線粒體融合蛋白1（mitofusin 1，MFN1）、MFN2 和電壓依賴性陰離子通道1（voltage-dependent anion channel 1，VDAC1）］泛素化。微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）適配體蛋白識別泛素化底物蛋白，結合LC3 進入自噬體后再與溶酶體結合，最終降解受損線粒體［41］。

綜上所述，正常生理狀態下，PINK1 被轉運至線粒體內部，并被蛋白酶降解。當線粒體發生損傷時，線粒體外膜電位降低，PINK1 聚集于線粒體外膜，通過自身磷酸化完成激活。激活后的PINK1 募集parkin 至線粒體外膜并將其磷酸化，磷酸化的parkin 泛素化線粒體膜上底物蛋白，泛素化的受損線粒體與自噬體結合，隨后與溶酶體融合被裂解［42］。

2.2 PINK1/parkin介導的線粒體自噬在心力衰竭中的作用 心肌細胞內線粒體產生的ROS可參與心血管疾病的發生發展。在正常生理條件下的ROS激活線粒體自噬，發揮維護心臟和血管穩態的功能。而過度應激下，ROS 逐漸積累導致線粒體功能障礙，心肌細胞和血管內皮細胞受到氧化損傷，是引起心衰的主要原因。近年來研究表明，PINK1 在線粒體膜外聚集可以反映線粒體的損傷。由PINK1 介導的線粒體自噬將受損線粒體作為降解靶點，并不針對健康的線粒體，并且PINK1 介導囊泡形成，維持線粒體池平衡，不完全清除線粒體，這對機體有益。所以PINK1/parkin 介導的線粒體自噬是線粒體自噬的重要類別，對維持心肌細胞內穩態、促進心肌細胞存活有重要作用，可以作為治療心衰的潛在靶點［18］。

Song等［43］發現，MFN2基因變異小鼠的心肌細胞中，parkin 介導的線粒體自噬減少，誘發心肌肥大和心衰。PINK1基因或parkin基因敲除小鼠心肌細胞的線粒體功能受損，心肌梗死面積增大，心臟收縮功能下降，對心肌缺血性損傷的敏感性更高，而PINK1和parkin 過表達可以減輕心肌細胞損傷［44］。Wang等［30］的實驗結果顯示AMPKα2 與磷酸化的PINK1 相互作用，增強PINK1/parkin 介導的線粒體自噬，阻止了心衰進展。趙佳［45］發現過表達WDR26 可以促進parkin向線粒體轉位，誘導缺氧心肌細胞的線粒體自噬，在心肌缺血時起內源性保護作用。Dadson 等［46］發現E3 泛素連接酶Mule 在終末期的心衰患者左心室的表達顯著下降。通過構建Mule基因敲除小鼠模型發現小鼠心肌內c-Myc多聚泛素化被阻止，導致c-Myc 聚集并減少了PINK1 和線粒體復合蛋白的表達，因此這些小鼠出現了心肌肥厚和左心室功能障礙。當Mule 和c-Myc 共同缺失時，減緩了由于Mule敲除導致的PINK1 表達水平下降，減緩了心衰和心肌肥厚的發生。此外，臨床上發現晚期心衰患者的PINK1 蛋白水平顯著降低，且晚期心衰患者線粒體自噬效率低下，而PINK1 和parkin 的正常表達可以減輕心肌細胞的損傷，延緩心衰的發展，延長患者生命［47］。

綜上所述，這些研究表明PINK1/parkin 信號通路在心臟體內穩態的維持發揮重要作用，對心肌細胞具有一定的保護作用。PINK1/parkin 水平的下調是導致線粒體自噬障礙和加重心衰的重要原因。線粒體自噬的失調導致異常線粒體積累、心肌細胞凋亡及心臟收縮功能障礙，最終引起心衰。

2.3 PINK1/parkin介導的線粒體自噬靶向治療心力衰竭 隨著藥物治療、介入治療和外科治療等一系列療法的發展，心衰的治療工作取得了顯著進展，但對心衰的預后仍不完全滿意，因此，需要做更多的工作來進一步尋找新的治療靶點。近年來諸多研究發現PINK1/parkin 介導的線粒體自噬通路可以作為治療心衰的潛在靶點。

在關于黃連素的研究中，敲除PINK1基因后，parkin介導的線粒體泛素化被顯著抑制，抵消了黃連素對心衰的有益作用［48］，表明黃連素可促進PINK1/parkin 信號通路介導的線粒體自噬，用于心衰的治療。Qiu 等［49］在采用結扎左前降支8 周建立的晚期心衰小鼠模型中，心肌中PINK1 和parkin 蛋白水平降低；用心復康口服液灌胃可以顯著糾正PINK1 和parkin 蛋白的表達降低，從而通過PINK1/parkin 信號通路的調控作用而改善心功能。

在TAC 誘導小鼠的心衰模型中，通過重組9 型腺相關病毒介導在心肌細胞中高表達AMPKα2，能夠激活PINK1 上Ser284 和Ser495 位點的磷酸化作用，從而增加PINK1/parkin 信號通路在線粒體自噬方面的作用而緩解心衰［30］。在Yu 等［50］采用TAC 法構建小鼠心衰模型中，線粒體鈣單向轉運體（mitochondrial calcium uniporter，MCU）抑制劑釕紅給藥7周可顯著改善心功能，MCU 的抑制維持了線粒體的穩態并上調了PINK1 和parkin 的表達水平。同樣在小鼠心衰模型中，在心肌細胞中ASB14（ankyrin repeat and SOCS box-containing 14）高表達能夠促進PINK1/parkin 信號通路的表達，激活E3 泛素連接酶活性，通過泛素化介導線粒體自噬，從而發揮改善心功能的作用［51］。在血管緊張素II 介導的小鼠心衰模型中，使用辛伐他汀后的小鼠PINK1 和parkin 蛋白表達顯著增加，促進線粒體自噬以對抗血管緊張素II 誘導的線粒體損傷，防止心肌線粒體繼續損傷，改善心功能［52］。此外，Xiong 等［44］發現，在血管緊張素II 誘導的小鼠心衰模型中，過表達PINK1 可以促進parkin轉位至受損線粒體外膜并磷酸化，維持心肌細胞穩態，減輕心肌損傷。

綜上所述，PINK1和parkin表達上調可以減輕線粒體損傷和緩解心衰。PINK1/parkin 信號通路作為目前最成熟的哺乳動物線粒體自噬機制，具有廣泛的應用前景，靶向調控該信號通路以改善線粒體自噬在未來可以成為治療心衰患者的新手段。

3 結語

在心衰條件下，PINK1和parkin上調了線粒體自噬水平，對維持心肌細胞穩態和功能結構發揮了重要的作用。心衰常發生在老年人群，隨著全球人口老齡化加速，對心衰治療的要求越來越高。根據目前的研究，靶向調控線粒體自噬以治療心衰變得更為現實。PINK1/parkin 信號通路上存在許多潛在的治療靶點，可以通過靶向控制通路達到治療心衰的目的。但是，在運用該信號通路作為治療靶點時仍存在以下障礙：（1）線粒體自噬水平過度上調是有害的，如何適當適時地調控線粒體自噬水平顯得尤為重要；（2）線粒體動力學代謝與線粒體自噬在維持線粒體質量時相互影響，因此調控PINK1/parkin 信號通路可能對線粒體動力學代謝產生不利影響；（3）線粒體自噬狀態在疾病中是動態變化的，需要在不同疾病狀態準確調控線粒體自噬。因此，目前需要更多的研究來理解線粒體自噬水平的調節機制及過度應激對線粒體自噬的影響，進一步揭示在人體內線粒體自噬與心衰的關系，為心肌保護提供新思路。