長鏈非編碼RNA HOTAIR與甲狀腺癌生物學(xué)行為的研究進展*

朱春悅， 張風(fēng)華， 孫含笑， 馮哲明， 李 寧， 洪方成， 鄭玉鑫

（1華北理工大學(xué)研究生學(xué)院，河北唐山 060000；2河北省人民醫(yī)院腺體外科，河北石家莊 050051）

甲狀腺癌是目前臨床上發(fā)病率上升最快的惡性實體腫瘤，且在女性多發(fā)，約占全身惡性腫瘤的1%左右［1］。到2019 年，甲狀腺癌在女性惡性腫瘤中排名第三［2］。甲狀腺癌根據(jù)其組織病理學(xué)特點可分為甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）、甲狀腺濾泡狀癌（follicular thyroid carcinoma，F(xiàn)TC）、甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）及甲狀腺未分化癌［anaplastic（undifferentiated）thyroid carcinoma，ATC］［3］。近年來，大多數(shù)甲狀腺癌患者在接受手術(shù)、放射性碘和內(nèi)分泌輔助治療后預(yù)后較好，但遠期復(fù)發(fā)率仍較高。因此，研究甲狀腺癌發(fā)生的分子機制，尋找新的生物標(biāo)志物和治療靶點是十分有必要的。

在人類基因組中，僅約2%的基因具有蛋白質(zhì)編碼功能，大多數(shù)基因序列不參與蛋白質(zhì)編碼，卻被轉(zhuǎn)錄生成非編碼RNA。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是長度大于200個核苷酸的一類非編碼RNA，雖不參與蛋白質(zhì)編碼過程，但可在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮重要調(diào)控作用。HOX 轉(zhuǎn)錄物反義RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）是被研究最為廣泛的lncRNA，在多種腫瘤中過表達，尤其在甲狀腺癌，故本文闡述了HOTAIR的可能作用機制，并總結(jié)其與甲狀腺癌關(guān)系的最新研究進展。

1 HOTAIR結(jié)構(gòu)及作用機制

2007 年，Rinn 等［4］首次在人成纖維細胞同源異形框C（homeobox C，HOXC）基因座的研究中發(fā)現(xiàn)了HOTAIR，其編碼基因位于染色體12q13.13 的HOXC位點上，由6個外顯子組成，長約2.2 kb（圖1）［5］。與其他lncRNA 不同，HOTAIR 是從HOXC基因的反義鏈轉(zhuǎn)錄而來的，不編碼任何功能性蛋白質(zhì)。HOTAIR基因結(jié)構(gòu)保守性較高，序列保守性較差，僅在哺乳動物中發(fā)揮重要調(diào)控作用［6］。Mozdarani 等［7］發(fā)現(xiàn)，HOTAIR 的第6 長外顯子由2 個結(jié)構(gòu)域（A 和B）組成，其中B結(jié)構(gòu)域較保守，可能是其核心結(jié)構(gòu)區(qū)域。

Figure 1. Structure of HOTAIR［5］.圖1 HOTAIR的結(jié)構(gòu)

HOTAIR最經(jīng)典的作用機制是發(fā)揮lncRNA支架分子功能，招募賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（lysine-specific histone demethylase 1，LSD1）和多梳抑制復(fù)合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）形成組蛋白修飾復(fù)合體，參與腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移以及凋亡基因激活與沉默。這一機制緣于HOTAIR 具有雙向結(jié)合能力（圖2A），其5′末端的89 bp 片段與PRC2 結(jié)合，PRC2 由EZH2、EED 和SUZ12 亞基及組蛋白分子伴侶組成，通過介導(dǎo)組蛋白H3第27位賴氨酸的三甲基化（H3K27me3）導(dǎo)致基因沉默表達；3′末端的646 bp 片段與LSD1/CoREST/REST 復(fù)合物結(jié)合，通過介導(dǎo)H3 組蛋白第4 位賴氨酸二甲基化（H3K4me2）而調(diào)控下游基因表達。LSD1 和PRC2 調(diào)控的靶基因極為廣泛，因此，HOTAIR 表達失調(diào)會導(dǎo)致復(fù)雜的惡性生物學(xué)行為，比如敲除HOTAIR的小鼠會出現(xiàn)同源異形轉(zhuǎn)化和脊柱彎曲等畸形［8］。

HOTAIR除了發(fā)揮支架作用外，還可調(diào)控細胞周期依賴激酶的表達，如cyclin D1［9］；誘導(dǎo)WIF-1啟動子區(qū)域H3K27 甲基化而激活Wnt/β-catenin 通路（圖2A）［10］；c-Myc 可直接與HOTAIR啟動子區(qū)E-box 元件結(jié)合而調(diào)節(jié)其活性［11］；與miRNA 位點結(jié)合形成競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)揮“海綿”作用而激活相關(guān)信號通路，促進腫瘤細胞增殖（圖2B）［12］。陳文慧等［13］發(fā)現(xiàn)，HOTAIR在鼻咽癌中高度表達，且與其無進展生存率和總生存率密切相關(guān)。HOTAIR 可促進人急性淋巴細胞白血病細胞增殖并抑制其凋亡，還能上調(diào)其化療藥物的作用靶點GR，提高其敏感性［14］。HOTAIR 在食管癌組織中過度表達，且與食管癌的TNM 分期及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)［15］。這些研究提示HOTAIR參與不同腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲過程，并可作為一個新的生物標(biāo)志物。

Figure 2. Schematic diagram of typical mechanism of HOTAIR.A："stent"and induction；B："sponge"function.圖2 HOTAIR典型作用機制示意圖

2 HOTAIR與甲狀腺癌

2.1 HOTAIR與甲狀腺癌早期診斷 甲狀腺結(jié)節(jié)是臨床上十分常見的疾病，且大多數(shù)為良性病變，目前，超聲和細針穿刺活檢（fine-needle aspiration biopsy，F(xiàn)NAB）是確定結(jié)節(jié)良惡性最可靠的檢查，根據(jù)細胞學(xué)分期評估，所有表現(xiàn)出可疑特征的甲狀腺結(jié)節(jié)和中高危結(jié)節(jié)的患者均可接受手術(shù)［16］，但FNAB 用于檢測甲狀腺癌仍有20%漏診率［17］，因此尋找新的生物標(biāo)志物對于提高甲狀腺癌的檢出率是必要的。由于HOTAIR 在PTC 中高表達，而在良性病變中低表達甚至不表達，因此HOTAIR 對于診斷甲狀腺癌是一個特異性較高的生物標(biāo)志物。甲狀腺癌細胞和HOTAIR異常表達產(chǎn)物均可進入血液循環(huán)，若能在血樣本中檢測到HOTAIR 的變化，無疑會提高鑒別的準(zhǔn)確性，從而協(xié)助臨床醫(yī)生診斷甲狀腺癌并制定有效合理的治療方案。然而，迄今為止，這方面尚未取得實質(zhì)性進展。

2.2 HOTAIR 與甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展 Di 等［18］通過實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)HOTAIR 在甲狀腺癌細胞系（TPC-1、FTC-133、B-CPAP 和SW579）中表達顯著高于癌旁組織，下調(diào)HOTAIR 可誘導(dǎo)甲狀腺癌細胞凋亡，并能顯著抑制體內(nèi)、外甲狀腺癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。Jiang 等［19］為PTC 建立了異常表達的lncRNA-mRNA-miRNA ceRNA 網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)ceRNA網(wǎng)狀調(diào)節(jié)模式在轉(zhuǎn)錄后水平對腫瘤的發(fā)生具有重要作用，且PTC中有6個lncRNA與總體生存期相關(guān)，其中包括HOTAIR，但相關(guān)分子機制仍需進一步研究。

與蛋白質(zhì)編碼基因相似，HOTAIR以堿基互補配對的形式出現(xiàn)在miRNA 靶基因中。最近，大量研究表明miR-1 在腫瘤發(fā)展中起著重要作用。例如，miR-1 通過調(diào)控大腸癌中CVB3 而有抗腫瘤功效［20］，靶向肺腺癌中的表皮生長因子受體酪氨酸激酶作為腫瘤抑制劑［21］，抑制結(jié)腸癌中的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［22］。先前文獻已表明，HOTAIR 通過抑制miR-1 和激活CCND2促進甲狀腺癌的發(fā)生和進展［18］。miR-488-5p 已被證明是甲狀腺癌抑制因子，在甲狀腺癌中，miR-488-5p對HOTAIR呈負相關(guān)調(diào)節(jié)［23］；在軟骨細胞HOTAIR轉(zhuǎn)錄物中miR-17-5p 通過Wnt/β-catenin 途徑間接上調(diào)FUT2 水平而促進骨關(guān)節(jié)炎進展［24］。miR-17-5p 是miR-17-92 簇的成員，位于染色體13q31～32，在多種細胞過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，也會抑制HOTAIR表達。Liu 等［25］利用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p的上調(diào)抑制甲狀腺癌細胞的存活、遷移和侵襲。在甲狀腺癌細胞HOTAIR 轉(zhuǎn)錄本第6 長外顯子有miR-141 靶點，miR-141 是miR-200 家族成員，而miR-200家族是抑制EMT 最有效的miRNA 之一［26］。這可能也是HOTAIR促進腫瘤發(fā)展的原因。

HOTAIR介導(dǎo)的腫瘤調(diào)節(jié)，其主要的機制是上調(diào)的HOTAIR 將PRC2 介導(dǎo)的基因抑制從癌基因轉(zhuǎn)移到抑癌基因。EZH2 的致癌功能與PRC2 有關(guān)，即通過H3K27me3 抑制腫瘤抑制基因［27］。Ren 等［28］在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，AC1NOD4Q（ADQ）可與HOTAIR 的5′功能域中36G46A 位點特異性結(jié)合，阻止HOTAIR與EZH2 相互作用以及PRC2 對靶基因的募集，從而達到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用。HOTAIR 也可通過影響細胞周期促進腫瘤增殖。Di等［18］發(fā)現(xiàn)，敲減HOTAIR可誘導(dǎo)TPC-1和FTC-133細胞周期停滯于G1/S 期，加速甲狀腺癌細胞的凋亡，最終抑制其增殖。

2.3 HOTAIR 與甲狀腺癌轉(zhuǎn)移、侵襲 甲狀腺癌組織高表達HOTAIR，并且高表達HOTAIR 與甲狀腺癌大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)［29］。正常的上皮組織是不利于惡性腫瘤細胞侵襲的，腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移與腫瘤細胞的EMT 有關(guān)，EMT 是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程，決定腫瘤的進展程度［30］。研究表明，HOTAIR作為腫瘤生長誘導(dǎo)因子，可誘導(dǎo)EMT 相關(guān)分子vimentin、N-cadherin、E-cadherin 及Wnt 信號通路相關(guān)分子β-catenin、Snail、ZEB1 表達［31］。在EMT 期間，HOTAIR 通過EZH2 與miR-124/506 結(jié)合，從而調(diào)節(jié)H3K27me3 狀態(tài)［32］。HOTAIR 也可通過抑制EMT 抑制劑Wnt 抑制因子1（Wnt inhibitory factor-1，WIF-1）而介導(dǎo)EMT［33］。敲除HOTAIR顯著上調(diào)WIF-1 和Ecadherin 表達，下調(diào)β-catenin 表達，啟動EMT 過程，加速腫瘤轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞的EMT 是由Wnt/β-catenin信號通路調(diào)節(jié)的，其中Snail 和ZB1 的表達在癌細胞增殖和凋亡中起著重要作用［34］。HOTAIR 在未成熟乳腺癌組織中表達要比成熟乳腺癌組織低，這種明顯的差別可能歸因于腫瘤微環(huán)境中存在大量的腫瘤生長因子。在甲狀腺癌中，TGF-β 可使PTC 細胞系中HOTAIR 表達增加，繼而誘導(dǎo)EMT 過程［35］?？傊?，HOTAIR 促進EMT 相關(guān)基因表達，從而促進腫瘤細胞的侵襲。

2.4 HOTAIR 單核苷酸多樣性（single-nucleotide polymorphism，SNP）與甲狀腺癌 甲狀腺癌作為威脅人類健康的腫瘤，其發(fā)病機制是由多因素、多機制相互作用導(dǎo)致的，其中，遺傳因素被認為是驅(qū)動甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的始動因素。SNP 是指單個核苷酸突變引起DNA 序列的多態(tài)性，在遺傳變異不同階段中發(fā)揮重要作用。全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）確定至少10 個SNP 與PTC 相關(guān)［36］。然而，HOTAIR在甲狀腺癌中表達升高是否由擴增、點突變等遺傳變異引起尚不清楚。研究顯示，HOTAIR 內(nèi)含子2 區(qū)域中存在一種潛在的增強子，該增強子定位在轉(zhuǎn)錄起始位點的+1 719 bp和+2 353 bp之間，可促進rs920778 對HOTAIR 等位基因表達的調(diào)控，與甲狀腺癌發(fā)病風(fēng)險相關(guān)［37］。Zhu等［38］在三組PTC 病例對照中探討了HOTAIR 的3 個單倍體標(biāo)記SNP（rs920778 C＞T、rs1899663 G＞T 和rs4759314 A＞G）與PTC 敏感性之間的相關(guān)性，其中HOTAIR rs920778 的多態(tài)性與PTC 風(fēng)險之間存在顯著聯(lián)系，尤其在女性有統(tǒng)計學(xué)意義，與rs920778 CC 攜帶者相比，rs920778 TT/CT 攜帶者患PTC 風(fēng)險增加1.40 或1.66 倍。Wang 等［39］發(fā)現(xiàn)，PTCSC3（papillary thyroid carcinoma susceptibility candidate 3）位于rs944289 下游附近，是GAWS 鑒定的甲狀腺癌易感性基因之一。PTC 的另一易感基因PTCSC2位于含有rs965513 的染色體9q22 基因座上，且與PTC 風(fēng)險相關(guān)［40］。這些研究結(jié)果可能部分解釋了甲狀腺癌具有遺傳傾向。

3 小結(jié)

既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)lncRNA HOTAIR 的失調(diào)會促進惡性腫瘤的發(fā)展。HOTAIR已被賦予癌基因的標(biāo)簽。在這里我們重點強調(diào)了HOTAIR 的異常表達對甲狀腺癌診斷、增殖、侵襲及EMT的影響。過表達的HOTAIR 可促進肝細胞癌細胞外泌體分泌和微血管向質(zhì)膜轉(zhuǎn)運［41］。在黑色素瘤中HOTAIR 可作為腫瘤疾病期循環(huán)細胞的標(biāo)志物、治療反應(yīng)的指標(biāo)及監(jiān)測疾病復(fù)發(fā)的指標(biāo)［42］。因此，了解HOTAIR 的潛在機制不僅可以明確HOTAIR 是預(yù)測甲狀腺癌易感性和預(yù)后的生物標(biāo)志物，還可以幫助臨床醫(yī)生為患者制定合理有效的治療方案。

但是，HOTAIR 進一步應(yīng)用于臨床仍有不少挑戰(zhàn)：首先，HOTAIR 參與甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制尚未完全闡明，如受HOTAIR 調(diào)控的基因除了Wnt通路，是否還有其他信號通路參與甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展，HOTAIR 是否參與甲狀腺癌耐藥，都有待進一步研究；其次，HOTAIR 檢測與FNAB 結(jié)合雖然可早期鑒別良惡性病變、判斷甲狀腺類型，但是該檢測方法流程復(fù)雜、費用高昂，還處于瓶頸期，仍需在未來開展更深入的研究。