環狀RNA在膠質瘤中的研究進展△

劉超，吳文松，孫程圓，何秋果，鄭克彬

河北大學附屬醫院神經外科，河北 保定 071000

神經膠質瘤是中樞神經系統中常見的惡性腫瘤，占全部惡性腦腫瘤的80%以上，具有高發病率和高病死率的特征，中位總生存期為37.6個月。盡管在膠質瘤治療中，手術治療聯合放療或化療取得進展，但是患者復發率較高，預后較差，其原因除了膠質瘤細胞增殖快、侵襲廣、腫瘤內和腫瘤間遺傳異質性、治療耐藥外，還源于對分子發病機制認識不深，缺乏及時診斷的手段。因此，闡明膠質瘤發生發展的分子機制，以及進一步探索可靠的診斷和治療方法是至關重要的。

環狀 RNA（circular RNA，circRNA）是一種具有共價閉環結構的新型RNA，是近年來非編碼RNA研究領域的新熱點。早在20世紀70年代，在病毒中就首次發現了少數這種RNA，并認為它們是RNA剪接中產生的錯誤產物。然而，隨著RNA測序技術和生物信息學的不斷發展，Memczak等和Hansen等在circRNA生物學功能研究方面取得突破，首次提出circRNA可以作為miRNA的分子海綿進行基因表達的調控，并在轉錄后過程中發揮作用。此后，circRNA開始受到公眾的廣泛關注，并對其生物特征、功能機制以及在臨床診斷和治療中的潛在應用進行了相關研究。目前，越來越多的circRNA被發現在轉錄、轉錄后和翻譯水平調控基因表達，它們通過調節選擇性剪接、海綿化miRNA、抑制功能性蛋白、編碼蛋白等參與膠質瘤的病理過程。多種circRNA在膠質瘤中異常表達，circRNA在膠質瘤的生長、轉移、復發和治療耐藥性中發揮重要作用。鑒于circRNA具有高豐度、穩定性、保守性和組織特異性，并且廣泛存在于各種體液中，因此探索膠質瘤相關的circRNA作為生物標志物或靶點，將為膠質瘤的早期診斷、預后和有效治療做出重要貢獻。本文就circRNA的生物起源、生物學特性和功能進行綜述，重點介紹circRNA與膠質瘤的關系及其在治療中的臨床意義。隨著對circRNA與膠質瘤關系認識的加深，將會發現更多關于膠質瘤進展的分子機制，并為膠質瘤的診治提供新的治療策略。

1 circRNA的概述

1.1 circRNA的生物起源

目前所發現的circRNA主要存在于細胞質中，并且具有組織特異性。circRNA的組成主要包括3種，由外顯子拼接組成的circRNA（exon circRNA，ecircRNA），僅由內含子組成的circRNA（circular intron RNA，ciRNA），以及同時由外顯子和內含子而組成的circRNA（exon intron circRNA，EIciRNA）。

ecircRNA能夠競爭性地與miRNA結合，從而影響下游基因的表達。ecircRNA的生物合成主要通過套索驅動、內含子配對驅動和RNA結合蛋白（RNA binding protein，RBP）驅動的環化來實現，但研究表明內含子配對驅動的環化是合成ecircRNA最常見的方法。EIciRNA被認為是ecircRNA形成的中間產物，研究表明，EIciRNA是內含子與外顯子穩定保留的結果，與ecircRNA不同，ciRNA和EIciRNA可調節RNA聚合酶Ⅱ和U1小核糖核蛋白的相互作用。

1.2 circRNA的生物學特性

細胞中circRNA生物學特性包括高豐度性、高度保守性、穩定性以及時空特異性。

1.2.1 高豐度性circRNA分布廣泛，具有高豐度性的特性。在人成纖維細胞中已鑒定出25 000多種不同的circRNA，其中有14.4%的活躍轉錄基因可以產生ecircRNA。某些circRNA的豐度是線性RNA的十倍以上。此外，在人類、小鼠、植物、古生菌、線蟲等多種物種中同樣也發現了circRNA。

1.2.2 高度保守性circRNA在真核生物中表達，在不同的物種中呈現出進化上的保守性。到目前為止，已經在人和鼠之間鑒定出69種反向剪接高度保守的circRNA。對3種類型circRNA序列的保守性進行研究，發現由外顯子組成的ecircRNA總體保守，由內含子組成的ciRNA與同時含有內含子和外顯子的EIciRNA也表現出高度的保守性。

1.2.3 穩定性circRNA具有很高的穩定性，circRNA的共價閉合能抵抗RNaseR、脫支酶以及RNA外切酶的降解，并且比線性轉錄本更穩定。circRNA在細胞中的平均半衰期超過48 h，比mRNA的半衰期（﹤10 h）長得多。

1.2.4 時空特異性circRNA在同一生物的不同發育階段、同一發育階段的不同部位均表現出表達差異性，這樣的差異豐富了生物多樣性，揭示了分子生物學的研究中生物機體運轉的高效性。

1.3 circRNA的功能

circRNA與傳統非編碼RNA有許多共同的功能。目前已報道circRNA的5種功能模型：①circRNA作為“miRNA海綿”，競爭性結合內源性miRNA；②circRNA作為“蛋白質海綿”，競爭性結合內源RNA結合蛋白；③circRNA作為“編碼RNA”，能夠直接編碼多肽或蛋白質；④circRNA作為“蛋白質支架”而發揮作用；⑤circRNA具有“朊病毒樣的功能”，能夠通過催化二級結構的改變，進而表現出朊病毒樣的活性。

1.3.1 circRNA作為miRNA海綿發揮作用 競爭性內源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）屬于非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）一般功能的家族成員之一，一些ceRNA可以競爭性地結合miRNA，從而阻止miRNA與其靶向的RNA結合，進而抑制這些miRNA的功能，稱為circRNA的miRNA海綿功能。

1.3.2 circRNA作為蛋白質海綿發揮作用circRNA還可作為蛋白質海綿，結合某些RNA結合蛋白，進而影響其蛋白質的功能和作用。circRNA蛋白質海綿的一個典型例子是circMBL，circMBL及其兩側的內含子含有幾個MBL結合位點，該circRNA能競爭性地與MBL蛋白結合，影響MBL蛋白的功能。

1.3.3 circRNA可以直接翻譯成多肽或蛋白質circRNA也具有編碼蛋白的潛力，Yang等報道了circRNA的翻譯被m6A修飾，在細胞質中，m6A結合蛋白YTH N6-甲基腺苷RNA結合蛋白3（YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 3，YTHDF3）和真核翻譯起始因子4γ2（eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 2，EIF4G2）促進 m6A 修飾circRNA的翻譯。Legnini等報道稱，circZNF609可以通過一種“非帽依賴”的翻譯機制進行翻譯。Zhang等報道稱circSHPRH也具有編碼能力，其翻譯的肽可以抑制膠質瘤的進展。

1.3.4 circRNA作為蛋白質支架的功能circRNA作為蛋白質支架，為蛋白質間的相互作用以及形成蛋白質功能復合物提供了場所。Li等報道了EIciRNA能與抗U1小核糖核蛋白抗體（U1 sn-RNP）結合，促進U1 snRNP與RNA聚合酶Ⅱ的結合，使得EIciRNA能作為U1 snRNP和RNA聚合酶Ⅱ復合物的蛋白質支架，進而增強宿主靶基因的轉錄。

1.3.5 circRNA具有朊病毒樣活性 核酶是一種可以催化特定生化反應的分子，circRNA具有像核酶一樣的功能。Badelt等報道了一種功能類似于朊病毒的circRNA分子，在這項研究中，作者設計了一種circRNA，它可以通過相互作用而觸發分子的自我催化復制，這項研究證明了circRNA也可能具有與朊病毒或核酶一致的特性。

2 circRNA在膠質瘤中的作用及機制

2.1 circRNA與miRNA相互作用調節膠質瘤進展

在膠質瘤中，circRNA與miRNA的相互作用是很常見的現象。據報道，hsa_circ_0000177在膠質瘤組織中表達上調，熒光素酶實驗證實了hsa_circ_0000177可作為靶向miRNA-638的海綿，結果表明，卷曲類受體7（frizzled class receptor 7，FZD7）是miRNA-638的靶基因，并被hsa_circ_0000177上調。進一步研究發現，hsa_circ_0000177阻斷WNT信號轉導，而miRNA-638抑制或FZD7恢復則促進WNT信號轉導，提示hsa_circ_0000177通過上調FZD7的表達促進WNT信號轉導，從而促進膠質瘤的黏附。另一項研究顯示，circ-ITCH正向調節腫瘤抑制基因ITCH的表達。circ-ITCH通過充當靶向miRNA-214的海綿并阻斷WNT/β-catenin信號轉導，促進ITCH的表達，從而阻斷腫瘤細胞增殖，然而circ-ITCH在膠質瘤組織中的表達下調。這兩種circRNA都通過WNT途徑調節腫瘤細胞的增殖。

Wang等報道circNT5E在膠質瘤細胞中過表達，circNT5E作為靶向miRNA-422a的海綿，在體內試驗中，circNT5E基因的敲除顯著抑制了U251細胞的生長、增殖、侵襲和遷移，并促進了細胞凋亡。Xu等發現，circNFIX作為miRNA-34a-5p的分子海綿，通過靶向circNFIX（si-circNFIX）或miRNA-34a-5p模擬物的小干擾RNA轉染膠質瘤細胞，從而抑制Notch信號通路下游蛋白he相關家族bHLH轉錄因子與YRPW基序2（hes related family bHLH transcription factor with YRPW motif 2，HEY2）、Jagged1和hes家族bHLH轉錄因子1（hes family bHLH transcription factor 1，HES1）的表達。將轉染了si-circNFIX的U87細胞注射到小鼠的右側肢體，與對照組相比，發現腫瘤的大小和體積都縮小了。提取小鼠腫瘤細胞，用定量逆轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）和Western blot法檢測circ-NFIX、miRNA-34a-5p和神經源性基因Notch同源蛋白1（neurogenic locus notch homolog protein 1，NOTCH1）的表達，結果表明si-circNFIX在體內通過抑制NOTCH1的表達而抑制膠質瘤的生長。

研究表明，circRNA在膠質瘤的發展過程中起到miRNA海綿的作用。例如，hsa_circ_0007534靶向miRNA-761上調了鋅指蛋白5（Zic family member 5，ZIC5）基因的表達，從而促進了膠質瘤細胞的增殖和遷移。hsa_circ_0046701靶向miRNA-142-3p調控ITGB8基因的表達。hsa_circ_0012129作為海綿靶向miRNA-661調控膠質瘤細胞增殖。hsa_circ_0008344的缺失可能通過與miRNA-433-3p/miRNA-450b-3p結合來抑制膠質母細胞瘤細胞的遷移和侵襲。circ-CFH作為靶向miRNA-149的海綿調控蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）1信號通路。在許多腫瘤中檢測到的circHIPK3能夠靶向miRNA-654調控腫瘤基因胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白3（insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 3，IGF2BP3），所有這些circRNA都在膠質瘤組織中上調。

在膠質瘤細胞中，circ-TTBK2與miRNA-217呈負相關，circ-TTBK2表達上調，miRNA-217表達下調。HNF1β基因是miRNA-217的靶點，在多種腫瘤中起癌基因的作用。miRNA-217能夠阻止circ-TTBK2介導的膠質瘤細胞進展。

另一項研究發現，CDR1反義RNA（CDR1 antisense RNA，CDR1-AS）在膠質瘤中的表達較正常腦組織下調，且與miRNA-671-5p的表達呈負相關。實驗數據表明，CDR1-AS的下調是由于miRNA-671-5p介導的CDR1-AS降解，而CDR1-AS是已知的唯一被miRNA-671-5p降解的circRNA。

綜上所述，circRNA和miRNA相互作用參與膠質瘤的形成和發展，并在膠質瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡中發揮重要作用。

2.2 circRNA編碼蛋白和RNA結合蛋白與circRNA結合參與膠質瘤的進展

circRNA除miRNA海綿的作用外，還可以編碼與疾病進展有關的蛋白質。Yang等發現，circ-FBXW7在膠質瘤中的表達低于正常腦組織。circ-FBXW7由FBXW7基因外顯子3和4組成，在circ-FBXW7中有一個潛在的開放閱讀框架，能夠編碼185個氨基酸的蛋白質，這個開放閱讀框架是可以翻譯的，在內部核糖體插入位點（internal ribosome entry site，IRES）的驅動下翻譯成蛋白質。雙熒光素酶載體系統表明，circ-FBXW7通過IRES元件的“非帽依賴”實現獨立翻譯。為了證實circ-FBXW7能夠在細胞中翻譯，將帶有標簽的質粒轉染293個T細胞中，并對其翻譯產物進行鑒定，結果表明帶有標簽的抗體僅存在于circ-FBXW7-FLAG和FBXW7-FLAG中。在轉染細胞中檢測到一個約22 kD的蛋白，表明該質粒已被翻譯（FBXW7-185aa）。研究人員隨后建立了circ-FBXW7和FBXW7-FLAG過表達載體，它們在U251和U373細胞中表達，并導致G期阻滯。當circ-FBXW7被敲除后，FBXW7-185aa的表達降低，細胞周期加快，細胞存活率提高。這些結果表明，FBXW7-185aa能夠誘導膠質瘤細胞周期阻滯并抑制膠質瘤細胞增殖。此外，FBXW7-185aa與泛素特異性蛋白酶28（ubiquitin specific peptidase 28，USP28）競爭性地相互作用并釋放FBXW7a來降解cmyc，cmyc是腫瘤發生的關鍵調控因子。在膠質瘤中，circ-SHPRH也能編碼蛋白質，在以往的研究中，circ-SHPRH被證明是肝細胞肝癌的生物標志物。Begum等表明，SHPRH作為一種重要的腫瘤抑制因子，circ-SHPRH能夠編碼新的蛋白SHPRH-146aa，采用液相色譜-質譜聯用技術，從circ-SHPRH中直接制備SHPRH-146aa，SHPRH-146aa還可以防止SHPRH降解，從而調節膠質瘤的進展。

另一項研究發現了circSMARCA5能與RBP結合，并在膠質瘤中表達降低，過表達circSMARCA5可以抑制腫瘤細胞的遷移。據預測，circSMARCA5富含RBP結合位點，在過表達circSMARCA5的U87MG細胞中，絲氨酸和富含精氨酸的剪接因子3（serine and arginine rich splicing factor 3，SRSF3）RNA異構體的表達增加，包含外顯子4。這個外顯子通常被依賴于SRSF1的方式跳過，SRSF1是一種已知的參與細胞遷移的腫瘤蛋白的正調控因子。SRSF3與另外兩種剪接因子，多嘧啶束結合蛋白1和2相互作用，正向調節膠質瘤細胞的遷移。

2.3 circRNA參與膠質瘤的血管生成并促進膠質瘤的發展

膠質瘤是一種典型的血管依賴性實體瘤，因此抗血管生成療法可以有效治療膠質瘤。circRNA參與了膠質瘤的血管生成，促進了膠質瘤的進展。

有研究發現沉默circRNA（cZNF292）可以抑制膠質瘤細胞的增殖，并指出調控腫瘤血管生成的關鍵因素包括血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生長因子和活性轉化生長因子-β1的水平。在cZNF292下調的U87MG和U251細胞株中，血管內皮細胞生長因子受體 1/2（vascular endothelial growth factor receptor 1/2，VEGFR1/2）表達和表皮細胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）受體表達及VEGFR-1/2磷酸化水平均降低。在cZNF292沉默的U87MG細胞中，細胞周期被阻滯在S/G/M期，并且細胞周期與血管生成密切相關。研究還發現，調控細胞周期進程的WNT/β-catenin信號通路成員包括βcatenin、腺瘤性結腸息肉病蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）、Axin、信號轉導及轉錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）、信號轉導及轉錄激活因子5（signal transduction and activator of transcription 5，STAT5），其表達也發生了相應的變化，表明WNT/β-catenin途徑下調了cZNF292的表達。因此，這個信號通路調節細胞周期以抑制腫瘤的血管生成。

有研究表明，circ-SHKBP1在膠質瘤血管內皮細胞（glioma vascular endothelial cell，GEC）中顯著上調，而下調circ-SHKBP1抑制了GEC的血管生成和血管生成因子1（angiogenic factor 1，AGGF1）的表達。該研究還發現，circ-SHKBP1是miRNA-544a/miRNA-379的功能靶點，而叉頭框蛋白1（forkhead box P1，FOXP1）和叉頭框蛋白 2（forkhead box P2，FOXP2）分別是miRNA-544a和miRNA-379的靶點。有研究表明，FOXP1可以促進腫瘤進展，調節血管功能。此外，miRNA-544a/miRNA-379抑制circ-SHKBP1介導的膠質瘤內皮細胞的血管生成，FOXP1/FOXP2通過上調AGGF1轉錄促進GEC血管生成。因此，circ-SHKBP1敲低或miRNA-544a/miRNA-379過表達可抑制膠質瘤的血管生成。

2.4 circRNA作為膠質瘤的治療靶點

circRNA在人腦膠質瘤中有多種作用，根據其功能特性，circRNA可能被用作治療的靶點。越來越多的研究表明，敲低某些特定circRNA可以顯著抑制細胞增殖、遷移或血管生成。siRNA可以針對某些特定的circRNA進行降解，可能是未來治療膠質瘤的一種好方法，而作為腫瘤抑制因子的circRNA過表達也可以作為治療策略的一部分。

circRNA的工程研究也取得了一些新的進展，這使得circRNA在膠質瘤治療中產生新方法。Wesselhoeft等發明了一種通過構建circRNA載體來表達蛋白質的新方法。由于circRNA與線性RNA相比更加穩定，因此基于circRNA的蛋白質表達可能會提高生產效率。結果表明，外源性circRNA能產生非常優質的蛋白質，且產量穩定，這表明circRNA可能是一種優質的、高效的RNA分子，可用于蛋白質表達。Meganck等構建了基于重組腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）載體的組織特異性circRNA表達載體。結果表明，該載體能在小鼠腦、眼和心臟中高效表達circRNA和翻譯的circRNA。根據以上兩篇報道，可以在不久的將來設計出基于蛋白表達系統具有特定腦靶向的circRNA來治療膠質瘤。

此外，circRNA的miRNA海綿功能也可用于膠質瘤的治療。Liu等報道了一種攜帶5個miRNA-21結合位點的circRNA，命名為scRNA21，它能顯著降低miRNA-21的表達水平，抑制胃癌細胞的增殖。這項工作雖然與膠質瘤無關，但針對特定miRNA的circRNA的設計和合成想法對膠質瘤的治療是有價值的。miRNA-21和許多其他miRNA在膠質瘤的發展過程中起著重要作用，這帶來了啟發，scRNA21也可以用來干擾膠質瘤中的某些miRNA。構建AAV的circRNA表達載體是實現這一想法的有力選擇。

3 小結與展望

膠質瘤是一種嚴重威脅人類健康的人腦惡性腫瘤。circRNA在人腦中大量表達，參與大腦發育的生理過程。circRNA參與了膠質瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和細胞周期進程，這對膠質瘤的診斷、預后和治療具有重要意義。circRNA可作為膠質瘤的生物標志物，因此具有診斷意義。circ-FBXW7和circ-SHPRH也可作為預后指標，幫助評估患者的預后。與siRNA相比，circRNA具有較少的脫靶和不良反應。因此，hsa_circ_0001649、cZNF292、hsa_circ_0046701、circNT5E 和circ-TTBK2等circRNA是更有利的分子治療靶點。circSMARCA與RBP SRSF1結合，是膠質瘤分子治療的潛在靶點和膠質母細胞瘤的藥物抑制劑。circ-SHKBP1在抗血管生成治療中也有潛在的應用價值。隨機RNA測序技術的應用，已經鑒定出許多重要的腫瘤RNA。值得注意的是，在膠質瘤的進展過程中，大多數circRNA被鑒定為miRNA海綿，這表明其他潛在的機制還需要進一步的探索。基于全球腫瘤負擔，還需要進一步的研究來揭示circRNA在膠質瘤發病機制中的潛在分子機制，并提高對所涉及的調控網絡的理解。最后，進一步闡明circRNA與膠質瘤發病機制的關系，將促進circRNA在腦膠質瘤診斷和治療中的臨床應用。