ALC1、miR-1299、COL5 A2與食管癌惡性生物學行為的關系及預測胸腹腔鏡外科手術后復發的效能

楊三虎 何偉

食管癌(esophageal cancer，EC)為臨床常見消化道腫瘤，多發于40歲以上人群，典型的癥狀為進行性咽下困難，嚴重影響患者生命健康及生活質量[1,2]。手術為治療EC最重要的方法，尤其是以胸腔鏡為代表的微創手術，較傳統手術具有更高有效性及安全性，臨床應用廣泛[3]。國內外均有報道指出，EC惡性生物學行為如腫瘤分化程度、淋巴轉移、腫瘤浸潤深度等，是腫瘤術后復發的危險因素[4,5]。研究指出，EC患者ALC1基因表達升高，可增強癌細胞增殖、侵襲及轉移能力，導致EC總生存率下降[6]。微小RNA-1299(miR-1299)被證實在EC組織中的表達水平降低，可能與癌細胞的遷移和侵襲能力相關[7]。此外，V型膠原蛋白α2鏈(COL5-A2)被認為是食管鱗癌發生、發展的關鍵基因，與患者預后密切相關[8]。基于此，本研究嘗試探究ALC1、miRNA-1299、COL5-A2與EC惡性生物學行為的關系及預測胸腹腔鏡外科手術后復發的效能，旨在為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年10月至2019年6月西安軍醫大學唐都醫院胸腹腔鏡外科手術治療后1年內復發的EC患者45例，作為研究組，其中男25例，女20例；年齡49～78歲，平均年齡(64.25±6.86)歲。另選取胸腹腔鏡外科手術治療后1年內未復發的EC患者45例，作為對照組，其中男28例，女17例；年齡47～79歲，平均年齡(63.58±7.7)歲。2組一般資料具有均衡性。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①EC的診斷及復發診斷均參照相關標準[9]，并經病理診斷確診；②符合EC手術指征[10]；③無神經系統疾病、心理障礙；④臨床資料完整；⑤患者知曉本研究，已簽署同意書。

1.2.2 排除標準：①血液系統疾病患者；②合并其他惡性腫瘤者；③嚴重心腦血管疾病患者；④免疫性疾病、感染性疾病患者；⑤肝腎等臟器功能嚴重障礙者。

1.3 方法

1.3.1 EC組織指標檢測方法：2組術后均留取EC組織，并于入組當天取活檢組織，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應法檢測各組織中ALC1、miR-1299、COL5-A2 mRNA表達水平，具體操作如下：稱取待檢組織100 mg，置于EP試管中，加入1 ml裂解液后充分研磨，隨后于低溫下提取總RNA，核酸測定儀測定RNA含量，將RNA反轉錄為cDNA，并進行擴增，條件為95℃ 5 min；95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，共40個循環，ALC1引物上游序列為：5’-GGTGGAGTTGGCATGA

ACTT-3’，下游序列為：5’-CACTCAACTGGAGGTCAG

CA-3’；miR-1299引物上游序列為：5’-TAAAGGTATG

GAGCGATGTGA-3’，下游序列為：5’-GGGTAGCGAA

AGGTGTAGAAG-3’；COL5 A2引物上游序列為：5’-AGGAACAGAAGTGCGAGGAGG-3’，下游序列為：5’-GGATGGAGTTGTCGGTGTAGATG-3’；上下游引物均購自廣州銳博生物科技有限公司，采用2-ΔΔCt法計算ALC1、miR-1299、COL5-A2 mRNA表達水平。

1.3.2 血清惡性生物學行為指標檢測方法：包括血清半乳凝素-9(galectin-9，Gal-9)、血管內皮生長因子(vascular epithelial growth factor，VEGF)、半乳糖凝集素-3(galectin-3)，采集患者術前空腹靜脈血3 ml，以3 500 r/min轉速、8 cm半徑離心處理5 min，取血清置于-70℃冷藏室保存，采用酶聯免疫吸附試驗檢測上述指標水平，試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司，檢測操作由專業人員嚴格按照試劑盒說明書完成。

1.4 觀察指標 (1)2組一般資料及血清Gal-9、VEGF、Galectin-3水平，一般資料包括年齡、性別、體質量指數(Body mass index，BMI)、吸煙、病理分型史、腫瘤位置、合并癥。(2)2組術后、入組時EC組織ALC1、miR-1299、COL5-A2 mRNA表達情況。(3)探究術后EC組織ALC1、miR-1299、COL5-A2 mRNA與血清惡性生物學指標的相關性。(4)術后EC組織ALC1、miR-1299、COL5-A2高表達與低表達者病理特征，包括年齡、性別、BMI、吸煙、病理分型史、腫瘤位置、合并癥、腫瘤分期、分化程度、淋巴轉移、腫瘤浸潤深度，腫瘤分期、分化程度、淋巴轉移、腫瘤浸潤深度均于術前參照相關指南[11]進行評估。(5)探究術后EC組織ALC1、miR-1299、COL5-A2表達水平與惡性生物學行為的關系，及預測EC術后復發的效能。

2 結果

2.1 2組一般資料、血清惡性生物學行為指標比較 2組患者年齡、性別比、BMI、吸煙、病理分型史、腫瘤位置、合并癥比較差異無統計學意義(P>0.05)；研究組患者血清Gal-9、VEGF、Galectin-3水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組一般資料、血清惡性生物學行為指標比較 n=45,例(%)

2.2 2組EC組織ALC1、miR-1299、COL5-A2 mRNA比較 研究組術后、入組時EC組織ALC1、COL5-A2 mRNA均較對照組高，miR-1299 mRNA較對照組低(P<0.05)。免疫組織化學法檢測顯示，研究組術后、入組時EC組織ALC1、COL5-A2呈強陽性表達，miR-1299呈弱陽性表達；對照組術后、入組時EC組織ALC1、miR-1299、COL5-A2呈弱陽性表達，miR-1299呈強陽性表達。見表2。

表2 2組EC組織ALC1、miR-1299、COL5-A2 mRNA相對表達量比較

2.3 ALC1、miR-1299、COL5-A2高表達與低表達者病理特征比較 以術后EC組織ALC1、miR-1299、COL5-A2平均值作為分界點，分為高表達、低表達患者。高表達與低表達患者的年齡、性別、BMI、吸煙、病理分型史、腫瘤位置、合并癥差異無統計學意義(P>0.05)；高表達與低表達患者的腫瘤分期、分化程度、淋巴轉移、腫瘤浸潤深度比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 ALC1、miR-1299、COL5-A2高表達與低表達者病理特征比較 例(%)

2.4 ALC1、miR-1299、COL5-A2表達與血清惡性生物

學行為指標的相關性 Spearman相關系數模型分析相關性，發現術后EC組織ALC1、COL5-A2表達與血清Gal-9、VEGF、Galectin-3間正相關，miR-1299與血清Gal-9、VEGF、Galectin-3間呈負相關(P<0.05)。見圖1～3。

圖1 ALC1與血清惡性生物學行為指標的相關性

2.5 ALC1、miR-1299、COL5-A2與惡性生物學行為的關系 Spearman相關系數模型分析相關性，發現術后EC組織ALC1、COL5-A2表達水平與腫瘤分期、分化程度、淋巴轉移、腫瘤浸潤深度間存在正相關關系，miR-1299表達水平與腫瘤分期、分化程度、淋巴轉移、腫瘤浸潤深度間存在負相關關系(P<0.05)。見表4。

圖2 COL5-A2與血清惡性生物學行為指標的相關性

圖3 miR-1299與血清惡性生物學行為指標的相關性

表4 ALC1、miR-1299、COL5-A2表達水平與惡性生物學行為的相關性分析

2.6 ALC1、miR-1299、COL5-A2預測復發的效能 繪制術后EC組織ALC1、miR-1299、COL5-A2聯合預測EC術后復發的ROC曲線，顯示各指標聯合預測的AUC最大，為0.872，最佳預測敏感度、特異度分別為86.67%、80.00%(P<0.05)。見表5，圖4。

表5 ALC1、miR-1299、COL5-A2預測復發的效能

圖4 ALC1、miR-1299、COL5-A2預測復發的ROC

3 討論

調查顯示，2018年全球36種癌癥中，EC的發病率和死亡率分別居第7位和第6位[12]。盡管近年來EC的診斷技術和多學科治療取得明顯進展，但EC患者的5年生存率仍然低于20%[13,14]。腫瘤的復發轉移，是導致預后不佳的主要因素，積極探索相關特異性生物標志物，對控制腫瘤進展、延長患者生存期具有重要意義[15,16]。

近年來，基因診斷與基因治療在惡性腫瘤中的作用越來越受臨床重視。ALC1為肝癌的最新候選癌基因，是從人體肝癌細胞的染色體1q21區分離并克隆的一個新基因，具有調控基因轉錄的功能，也是SNF-2類家族中具有致癌作用的基因[17,18]。但其在EC發生發展及復發中的作用鮮有研究報道。本研究發現，EC組織中ALC1基因表達水平明顯升高，胸腹腔鏡外科手術后其表達水平呈降低趨勢，但EC術后復發患者的EC組織中ALC1基因表達水平高于未復發患者，提示ALC1基因表達可能與EC的發生發展及術后復發有關，可能與其調控下游基因及促進細胞增殖相關。ALC1基因具有上調Cdk2及細胞周期蛋白CyclinE、下調蛋白p53及其下游效應基因p21表達的作用，能加速細胞G1期到S期的進程，且能促進DNA合成，從而促進腫瘤細胞增殖，導致腫瘤進展、復發[19]。

miR是一類高度保守的非編碼RNA，越來越多的證據指出miR在癌癥的基因表達調控和信號轉導通路中發揮關鍵作用[20,21]。有報道指出miR-1299可通過負向調控信號轉導及轉錄激活因子3信號通路，抑制癌細胞的遷移、侵襲[22]。本研究還發現，EC組織中miR-1299表達水平明顯降低，手術治療后其表達水平有升高，但術后復發患者的EC組織中miR-1299表達水平仍明顯偏低，可能與EC發生發展、術后復發有關。本研究還發現，COL5-A2基因在EC組織中的表達明顯升高，且術后復發患者高于未復發患者。COL5-A2是膠原家族的重要成員，被認為與癌癥發生有關，已有研究證實其在舌鱗狀細胞癌、膀胱癌組織中的表達均升高，可促進癌細胞增殖、轉移[23]。但其在EC中的具體作用機制尚未明確，仍有待進一步探究。

本研究分析其與EC患者血清Gal-9、VEGF、Galectin-3水平的相關性，結果發現血清Gal-9、VEGF、Galectin-3與術后EC組織ALC1、COL5-A2表達呈正相關，與miR-1299表達呈負相關。Gal-9可誘導巨噬細胞、T細胞、胸腺細胞等多種類型細胞的凋亡，與腫瘤的凋亡、轉移等機制密切相關[24,25]。VEGF為腫瘤血管生成的主要推動因子，可促進腫瘤內新血管形成，為腫瘤的增殖、轉移提供動力[26]。Galectin-3具有調節細胞生長、黏附、分化及凋亡的作用，可促進食管癌新血管生成及腫瘤的浸潤、轉移[27]。由此可見，ALC1、miR-1299、COL5-A2與EC惡性生物學行為有關。本研究還發現，腫瘤分期、分化程度、淋巴轉移、腫瘤浸潤深度與術后EC組織ALC1、COL5-A2呈正相關，與miR-1299呈負相關，進一步證實了ALC1、miR-1299、COL5-A2與EC惡性生物學行為均存在密切相關性。基于上述研究，我們首次采用ROC曲線探究ALC1、miR-1299、COL5-A2預測EC術后復發的效能，結果發現各指標預測EC術后復發的AUC均>0.7，具有良好預測價值，尤其是各指標聯合預測的AUC高達0.872，可為臨床預測患者術后復發風險提供更準確信息。

綜上所述，EC組織中ALC1、miR-1299、COL5-A2基因表達異常，與EC惡性生物學行為密切相關，且各指標聯合在預測患者術后復發方面具有良好效能，具有較高臨床應用價值。