Lnc RNA HNF1A-AS1靶向miR-32-5p調控肺癌對順鉑的耐藥性

張艷麗 唐文慧 蘇軍 馬紅霞

肺癌(lung cancer)是世界上發病率、死亡率最高的惡性腫瘤，威脅著世界人類的生命健康[1]。由于80%以上為非小細胞肺癌，其確診時大多已至晚期，失去最佳手術時機，放化療成為肺癌治療的首選[2]。順鉑是癌癥化療最主要的藥物，可抑制腫瘤細胞的DNA 合成，誘導癌細胞凋亡，達到抑制腫瘤細胞生長的作用[3]。其在肺癌早期和晚期均具有良好的抗癌作用，患者一旦產生耐藥性極易死亡。因此，耐藥成為克服肺癌治療的一大難題。非編碼RNA在各種人類疾病中的關鍵作用，其可分為短鏈RNA(18～23個核苷酸)和長鏈非編碼RNA(lncRNAs；>200 個核苷酸)[4]，其中lncRNA已經成為癌癥生物學研究中最主要的一類非編碼RNA，據報道lncRNA可通過靶向miRNA進而調控相關基因表達、蛋白質合成、RNA轉運等[5]。 研究發現lncRNAs也調節藥物轉運并最終調節抗性[6,7]。長鏈非編碼RNA HNF1A-AS1(Lnc RNA)在肺癌中發揮促進癌癥進一步惡化作用[8]，其對肺癌化療的敏感性是否也具有調控作用，尚且未知。本研究擬檢測順鉑耐藥肺癌細胞H520/DDP中HNF1A-AS1及miR-32-5p的表達，觀察其對H520/DDP順鉑敏感性、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 肺鱗狀細胞癌細胞H520購自ATCC；DMEM培養基、MTT均購自美國Sellect公司；逆轉錄試劑盒、LipofectamineTM2000購自大連寶生物工程公司；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司；PVDF膜購自德國Roche Diagnostics公司；ECL發光液購自Thermo Fisher Scientific公司；SDS-PAGE 試劑盒、RIPA蛋白裂解液均購自Beyotime Biotechnology；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:在37℃、5% CO2的恒溫培養箱中，肺鱗狀細胞癌細胞H520與含10%胎牛血清的DMEM培養基一起孵育，待H520細胞融合至約75%，胰蛋白酶消化(1 min左右)后以1∶3的比例替換DMEM培養基，每隔1 d傳代1次。

1.2.2 H520/DDP細胞的建立:將正常培養的H520細胞，用含順鉑(2、4、6、8、10、12、14、16……64 μmol/ml)的DMEM培養基培養至第30 d，依次每個濃度培養30 d。最后用64 μmol/ml的順鉑維持H520細胞的耐藥性，得到順鉑耐藥肺癌細胞H520(H520/DDP)。使用MTT法檢測不同濃度順鉑處理的H520細胞的抑制率，并測定H520細胞的順鉑IC50值。

1.2.3 細胞轉染與分組:將H520/DDP細胞隨機分為si-NC組(轉染si-NC)、si-HNF1A-AS1組(轉染si-HNF1A-AS1)、miR-NC組(轉染miR-NC)、miR-32-5p組(轉染miR-32-5p mimics)、si-HNF1A-AS1+anti-miR-NC組(共轉染si-HNF1A-AS1和anti-miR-NC)、si-HNF1A-AS1+anti-miR-32-5p組(共轉染si-HNF1A-AS1和anti-miR-32-5p)，通過LipofectamineTM2000轉染，用RT-qPCR法檢測轉染48 h的效率。轉染成功后，用于后續試驗。

1.2.4 MTT法檢測H520和H520/DDP細胞的IC50值:將H520和H520/DDP細胞分別制成104個/ml的混懸液，接種至96孔板，依次加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)孵育4 h，150 μl DMSO充分融解結晶，記錄490 nm處的H520、H520/DDP細胞吸光度(A)。根據[(1-A490樣品/A490對照)×100%]計算細胞抑制率(%)。以抑制50%細胞生長的藥物濃度為IC50值。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI檢測H520和H520/DDP細胞凋亡:用 500 μl的Binding Buffer懸浮H520或H520/DDP細胞，在黑暗中，將細胞與5 μl Annexin V-/ FITC孵育20 min，后與5 μl PI孵育20 min，于1 h內上流式細胞儀進行H520或H520/DDP細胞凋亡檢測。以晚期凋亡率之和為細胞的凋亡率(%)。

1.2.6 RT-qPCR法檢測細胞中HNF1A-AS1、miR-32-5p的mRNA的表達:遵循RNA抽提試劑盒步驟進行H520或H520/DDP細胞RNA提取，定量后分別利用逆轉錄試劑盒、RT-qPCR試劑盒進行cDNA制備、HNF1A-AS1、miR-32-5p表達檢測。用2-△△Ct=[(CT樣品-CTU6)Treatment group-(CT樣品-CTU6)Control group]計算HNF1A-AS1、miR-32-5p的mRNA的表達。

1.2.7 生物信息學分析:采用在線靶基因預測庫Target Scan(http://www.targetscan.org/)預測HNF1A-AS1與miR-32-5p的結合位點。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因檢測實驗檢測細胞的熒光活性:將HNF1A-AS1-WT和HNF1A-AS1-MUT的熒光素酶報告載體，通過脂質體LipofectamineTM2000，分別將其與miR-32-5p、miR-NC共轉染，按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒技術手冊操作，記錄24 h后的螢火蟲和海腎的熒光素酶激發值，根據二者之比評價細胞的熒光活性。

2 結果

2.1 順鉑耐藥肺癌細胞的建立 與H520組相比，H520/DDP組細胞的IC50值顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表1，圖1。

圖1 流式凋亡圖

表1 順鉑耐藥H520細胞的建立

2.2 順鉑耐藥肺癌細胞中HNF1A-AS1、miR-32-5p的表達 與H520組相比，H520/DDP組細胞中HNF1A-AS1 mRNA顯著升高，miR-32-5p mRNA顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 順鉑耐藥肺癌細胞中HNF1A-AS1、miR-32-5p的表達

2.3 抑制HNF1A-AS1對H520/DDP細胞IC50的影響 與si-NC組相比，si-HNF1A-AS1組H520/DDP細胞的IC50顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 抑制HNF1A-AS1的H520/DDP細胞凋亡

表3 抑制HNF1A-AS1對H520/DDP細胞IC50的影響

2.4 HNF1A-AS1靶向miR-32-5p 生物信息學預測顯示，HNF1A-AS1與miR-32-5p 5’UTR端部分堿基可互互補配對。miR-32-5p組WT-HNF1A-AS1細胞的熒光活性顯著低于miR-NC組，miR-32-5p組和miR-NC組MUT-HNF1A-AS1細胞的熒光活性差異不顯著(P<0.05)。anti-miR-32-5p組比anti-miR-NC組顯著提高細胞中HNF1A-AS1 mRNA的表達，miR-32-5p組較miR-NC組顯著降低細胞中HNF1A-AS1 mRNA的表達(P<0.05)。見圖3，表4、5。

圖3 HNF1A-AS1與miR-32-5p的靶向結合位點

表4 雙熒光素酶報告基因檢測實驗結果

表5 miR-32-5pHNF1A-AS1表達的影響

2.5 過表達miR-32-5p降低H520/DDP細胞IC50 與miR-NC組相比，miR-32-5p組H520/DDP細胞的IC50值顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖4，表6。

圖4 過表達miR-32-5p的H520/DDP細胞的凋亡

表6 過表達miR-32-5p對H520/DDP細胞IC50的影響

2.6 抑制miR-32-5p逆轉了抑制HNF1A-AS1對H520/DDP細胞IC50的影響 與si-HNF1A-AS1+anti-miR-NC組相比，si-HNF1A-AS1+anti-miR-32-5p組H520/DDP細胞的IC50值顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖5，表7。

表7 抑制miR-32-5p逆轉了抑制HNF1A-AS1對H520/DDP細胞IC50的影響

圖5 抑制miR-32-5p的H520/DDP細胞凋亡

3 討論

隨著人類對Lnc RNA認識的不斷深入，其從轉錄“噪音”至人類各種疾病的重要“參與者”，尤其是腫瘤[9]。研究發現，Lnc RNA在腫瘤中的異常失調，參與腫瘤的發生發展，甚至放化療抗性[10]。Wu等[11,12]在肺腺癌的研究中發現，HNF1A-AS1的表達量與肺癌的分期、腫瘤大小及淋巴轉移具有顯著相關性，促進體內和體外癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Zhang等[13,14]報道，HNF1A-AS1促進肺癌細胞增殖、遷移侵襲的機制與靶向miR-17-5p、miR-149-5p/Cdk6有關。這些研究結果說明HNF1A-AS1促進肺癌細胞的增殖、遷移侵襲，我們推測其對肺癌細胞凋亡和耐藥性應該也具有一定的影響。本研究通過逐步遞增法成功建立的順鉑耐藥H520細胞；用RT-qPCR法檢測了肺癌細胞H520和順鉑耐藥肺癌細胞H520/DDP中HNF1A-AS1的表達發現，HNF1A-AS1在H520/DDP中的表達顯著升高；進一步研究發現，抑制HNF1A-AS1可增強順鉑對肺癌細胞的敏感性，促進H520/DDP細胞的凋亡，這說明HNF1A-AS1是肺癌細胞耐藥性和凋亡過程的重要調控因子，為HNF1A-AS1為基礎的生物治療的開發提供了實驗依據。接下來的Target Scan預測、雙熒光素酶報告基因檢測及RT-qPCR實驗研究發現，miR-32-5p是HNF1A-AS1的功能性靶標，猜想HNF1A-AS1影響肺癌耐藥性和凋亡的作用可能與靶向肺癌細胞中的miR-32-5p聯系密切。

miRNA在人類機體的各種癌癥的發生發展及放化療抗性中均具有重要的調控作用。Zhou等[15]在肺癌的研究中發現，miR-32具有腫瘤抑制劑的作用，抑制肺癌細胞的增殖和侵襲，其可作為Linc 00319的靶基因參與肺癌的發生發展。Zhu等[16]報道，miR-32在非小細胞肺癌中的表達明顯下調，與肺癌的淋巴轉移、分期和總生存期均具有明顯的相關性，且過表達miR-32可抑制癌細胞的增殖、遷移侵襲，促進凋亡，表明miR-32可作為非小細胞肺癌的腫瘤抑制劑，并且可作為基于miRNA治療的新型治療劑。我們推測miR-32-5p在肺癌的順鉑耐藥性中可能也具有一定的調控作用。本研究檢測了順鉑耐藥肺癌細胞H520/DDP中miR-32-5p的表達發現，miR-32-5p異常降低，這與前人研究[16,17]相一致；此外，過表達miR-32-5p后，H520/DDP細胞對順鉑的敏感性顯著增強，細胞凋亡顯著增加，說明miR-32-5p不僅具有抑制肺癌細胞的惡性細胞表型的功能，還具有增強順鉑敏感性的功能，為順鉑耐藥肺癌細胞的治療提供新的治療靶點和新的方向。深入研究發現，抑制miR-32-5p可逆轉抑制HNF1A-AS1的增強H520/DDP細胞敏感性和促凋亡作用，這不僅說明HNF1A-AS1可靶向調控miR-32-5p，相反，miR-32-5p也可逆向調控HNF1A-AS1的表達和功能。

綜上所述，長鏈非編碼RNA HNF1A-AS1可增強順鉑耐藥肺癌細胞的敏感性，其機制可能與靶向miR-32-5p有關，為耐藥肺癌的治療提供新方向。