丹白顆粒對LPS誘導的子宮內膜上皮細胞TGF-β/Smad通路及上皮間質轉化的影響

王淑蘭 潘劍榕

子宮內膜炎是由于細菌入侵宮腔而導致的子宮內膜持續性炎癥病變，主要致病菌是大腸桿菌、鏈球菌等革蘭陰性菌[1]，臨床表現通常無癥狀或者月經失調、白帶增多和性質異常、下腹部墜痛等，但病情嚴重者可在生殖方面引起不孕癥[2]。臨床治療子宮內膜炎常用口服抗生素的方法，但細菌易產生耐藥性，治療效果不佳。丹白顆粒是一種中成藥，具有清熱化瘀，祛濕止痛的功效，常用于慢性盆腔炎。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是大腸桿菌細胞壁上的主要毒性因子，可誘導子宮內膜炎的發生[3]。上皮間質轉化(eputhelial-mesenchymal transition，EMT)是指在某些因素作用下上皮細胞轉化為間質細胞的一種生物現象[4]。通常情況下，發生EMT后，上皮組織不再具有保護和吸收的作用，上皮標記因子如鈣黏蛋白(E-cadherin)表達量減少，同時間質標記因子如波形蛋白(vimentin)表達量升高[5]。轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)在誘發MET過程中起重要作用，而Smads蛋白是TGF-β下游的信號蛋白，其中Smad2和Smad3是參與TGF-β1信號從細胞外傳導至細胞核內的關鍵因子[6]。本研究采用細胞體外實驗，旨在探究丹白顆粒含藥血清對LPS誘導的子宮內膜上皮細胞TGF-β/Smad通路及EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞與動物:人子宮內膜上皮細胞(貨號：CP-H058)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。120只SPF級健康小鼠(雄性，6周齡，體重23～27 g)購自重慶醫科大學動物實驗中心，符合國家實驗動物倫理保護標準及相關法律規定。實驗期間小鼠自由攝食和飲水。

1.1.2 實驗藥物:丹白顆粒(8 g×10袋)生產廠家山東新時代藥業有限公司，小鼠等效劑量根據人和動物之間按體表面積折算的等效劑量比計算，按生藥量計質量濃度為2、1、0.5 g/ml分別設為高、中、低劑量[7]。

1.1.3 主要試劑與儀器:LPS、含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM/F12培養基購自美國Giboc公司；四甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)和四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)均購自美國Sigma公司；IL-1β、TNF-α、IL-6和TGF-β1 ELISA試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)和β-actin鼠抗均購自美國Sigma公司；蛋白提取試劑盒、ECL顯色試劑盒和DAB蛋白定量試劑盒購自北京中山金橋生物科技有限公司；碘化丙啶(propidium lodode，PI)和96孔培養板購自上海生工生物工程有限公司；Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、E-cadherin和vimentin鼠抗、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG二抗均購自美國Abcam公司。酶標儀Fax-20100購自美國INStat公司；尼康SMZ745光學顯微鏡購自于上海普赫生物科技有限公司；蛋白凝膠成像儀購自美國Bio-Red公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:子宮上皮內膜細胞用含10% FBS的DMEM/F12培養基于37℃、5% CO2恒溫培養箱中，待細胞生長至80%融合時，2～3 d傳代1次。

1.2.2 含藥血清的制備:將120只小鼠隨機分為4組：丹白顆粒低(5 g/kg)、中(10 g/kg)、高(20 g/kg)含藥血清組和空白血清組，每組30只，每天按照相應劑量分別對4組小鼠灌胃給藥，給藥體積10 ml/kg，空白血清組給予等體積蒸餾水，2次/d，連續3 d，于最后一次給藥1 h后，股動脈取血。

1.2.3 實驗分組及藥物干預:子宮內膜上皮細胞隨機分為5組：對照組(DMEM/F12培養基加入5%空白血清和10 μg/ml PBS)；模型組(DMEM/F12培養基加入5%空白血清和10 μg/ml LPS[8])；低、中、高劑量丹白顆粒組(DMEM/F12培養基加入5%含低、中、高劑量丹白顆粒血清和10 μg/ml LPS)。

1.2.4 5組子宮內膜上皮細胞存活率的測定:收集上述1.2.3分組并培養24 h后的細胞，每組設置6個復孔，每孔加入10 μl的MTT繼續孵育4 h，吸取上清，加入150 μl的DMSO，充分震蕩混勻15 min后用酶標儀檢測各孔570 nm處OD值。細胞存活率(%)=(試驗組OD5 70 nm-空白組OD 570 nm)/(對照組OD 570 nm-空白組OD 570 nm)×100%。

1.2.5 ELISA法檢測5組細胞上清液TGF-β1的表達:收集上述1.2.3分組并培養24 h后的細胞，按照試劑盒操作說明測定5組細胞上清中IL-1β、TNF-α、IL-6、TGF-β1含量，每組設置3個重復。

1.2.6 蛋白免疫印跡法檢測Smad2、Smad3的磷酸化和E-cadherin、vimentin表達水平:收集上述1.2.3分組并培養24 h后的細胞，使用蛋白提取試劑盒提取各組細胞的總蛋白。使用BAC蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量，然后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、轉膜、抗體封閉、1∶2 000濃度稀釋后的Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、E-cadherin、vimentin鼠抗4℃過夜孵育、含辣根過氧化物酶綴合的二抗(1∶5 000)中室溫孵育2 h，用ECL顯色試劑盒顯色，凝膠成像儀拍照，分析灰度值，以β-actin為參照，每組設置3個重復。

2 結果

2.1 丹白顆粒含藥血清對LPS誘導的子宮內膜上皮細胞存活率的影響 與對照組相比，模型組子宮內膜上皮細胞存活率顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，丹白顆粒低、中、高劑量組子宮內膜上皮細胞存活率依次升高(均P<0.05)。見表1。

表1 5組子宮內膜上皮存活率比較

2.2 丹白顆粒含藥血清對LPS誘導的子宮內膜上皮細胞炎性因子和TGF-β1產生的影響 與對照組相比，模型組子宮內膜上皮細胞上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6、TGF-β1含量顯著增高(P<0.05)；與模型組相比，丹白顆粒低、中、高劑量組子宮內膜上皮細胞上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6、TGF-β1含量依次降低(P<0.05)。見表2。

表2 5組細胞上清液中炎性因子和TGF-β1含量比較

2.3 丹白顆粒含藥血清對LPS誘導的子宮內膜上皮細胞中Smad2、Smad3磷酸化水平的影響 與對照組相比，模型組子宮內膜上皮細胞中Smad2、Smad3磷酸化水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，丹白顆粒低、中、高劑量組子宮內膜上皮細胞中Smad2、Smad3磷酸化水平依次降低(P<0.05)。見表3，圖1。

表3 5組細胞中Smad2、Smad3磷酸化水平比較

圖1 5組細胞中Smad2、Smad3磷酸化水平比較

2.4 丹白顆粒含藥血清對LPS誘導的子宮內膜上皮細胞中E-cadherin和Vimentin表達的影響 與對照組相比，模型組子宮內膜上皮細胞中Vimentin表達水平顯著升高，E-cadherin的表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，丹白顆粒低、中、高劑量組子宮內膜上皮細胞中Vimentin表達水平依次降低，E-cadherin的表達水平依次升高(P<0.05)。見表4，圖2。

表4 5組細胞中E-cadherin和Vimentin表達水平比較

圖2 5組細胞中E-cadherin和Vimentin表達水平比較

3 討論

子宮內膜炎患者排卵期和黃體期的子宮內膜有異常收縮，不利于胚胎著床，子宮內膜炎與不孕癥和復發性流產相關[9]。抗生素是臨床上用于治療子宮內膜炎的常用藥物，但由于抗生素的濫用，引起子宮內膜炎的大腸桿菌等細菌產生了耐藥性，療效不佳。中醫藥的優點在近年來的疾病治療中逐漸凸顯，因此探討中藥對子宮內膜炎的作用機制是當下研究的熱點。

LPS是大腸桿菌等革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，能夠誘導子宮內膜炎、子宮內膜異位等疾病[10]。同時，Sun等[11]研究發現LPS能夠增強TGF-β1信號通路，而TGF-β1能夠誘導細胞分泌IL-1β、TNF-α和IL-6[12]。研究表明當機體處于正常狀態時，IL-1β、TNF-α和IL-6的分泌水平較低，當處于病理狀態時，分泌量提高，從而導致炎癥的發生和組織細胞的損傷[13]。Wang等[14]研究表明，在LPS誘導下，細胞炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6的分泌水平顯著升高，阻止此類炎性因子的過量產生，能夠有效防止機體損傷的產生。丹白顆粒是由牡丹皮、大血藤、紫花地丁、三棱、莪術、敗醬草、川芎、白芍、土茯苓、白英、白花蛇舌草、墓頭回、椿皮、當歸組成，具有清熱化瘀，祛濕止痛的功效。本研究表明，LPS誘導的子宮內膜上皮細胞存活率顯著降低，細胞上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6和TGF-β1含量顯著升高，經不同劑量丹白顆粒含藥血清干預后，細胞存活率依次上升，上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6和TGF-β1含量依次降低，提示丹白顆粒能提高細胞存活率，降低IL-1β、TNF-α、IL-6和TGF-β1含量，可能與TGF-β相關通路有關。

Smads是TGF-β信號通路的關鍵轉導分子，其中Smad2和Smad3蛋白參與TGF-β1在細胞膜上的的轉運，調控相關基因的轉錄，導致ECM發生，TGF-β/Smad信號通路是細胞上皮間質轉化的關鍵通路。研究發現TGF-β1能夠誘導EMT的發生[15,16]。Zhang等[17]研究表明激活TGF-β/Smad信號通路，能夠誘導EMT，促進胃癌細胞轉移。Chen等[18]研究發現TGF-β能夠通過TGF-β1/Smad信號通路誘導牛乳腺上皮細胞-間質轉化。EMT發生后致使E-cadherin表達量減少，vimentin表達量升高。本研究發現，LPS誘導的子宮內膜上皮細胞中Smad2、Smad3磷酸化水平和Vimentin表達水平顯著升高，E-cadherin表達水平顯著降低，經不同劑量的含丹白顆粒血清干預后，子宮內膜上皮細胞中Smad2、Smad3磷酸化水平和Vimentin表達水平依次降低，E-cadherin表達水平依次升高，提示丹白顆粒可能通過阻滯TGF-β/Smad信號通路，抑制EMT發生。

綜上所述，丹白顆粒能夠提高LPS誘導下子宮內膜上皮細胞存活率，抑制上皮間質轉化，緩解子宮內膜炎，可能與阻滯TGF-β/Smad信號通路有關。丹白顆粒可作為潛在的治療子宮內膜炎的藥物。然而，LPS誘導子宮內膜炎等疾病的作用機制十分復雜，尚需深入研究。