FOXF1-AS1負調控miR-146b-3p對宮頸癌細胞增殖凋亡的影響

閆咨儒 林娟 李娥瓊

宮頸癌是女性癌癥中死亡率第二位的癌癥，具有較高的發病率，尋找新的治療靶標和預后生物標志物以提高宮頸癌患者的存活率非常迫切[1]。研究表明長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在在宮頸癌的預后及各種生物學過程中都起著關鍵的調節作用，可作為宮頸癌診斷和預后生物標志物以及宮頸癌未來靶向治療的靶點[2]。長鏈非編碼叉頭蛋白F1-反義RNA1(lncRNA FOXF1-AS1)也稱為FENDRR，有報道lncRNA FOXF1-AS1在胃癌組織中表達下調，其表達水平與胃癌患者浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期有關，是影響患者預后的獨立危險因素，可作為患者預后判斷的參考指標[3]。FOXF1-AS1在肺癌中顯著下調表達，FOXF1-AS1穩定過表達通過調節上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)抑制肺癌細胞的遷移和侵襲[4]。然而FOXF1-AS1對宮頸癌細胞增殖凋亡的影響及其機制尚不清楚。microRNA參與調控宮頸癌的進展[5]，有報道miR-146b-3p下調抑制宮頸癌細胞的增殖，遷移和錨定非依賴性生長[6]。circ_0000520通過海綿化miR-146b-3p抑制宮頸癌細胞增殖，侵襲和遷移，同時促進宮頸癌細胞凋亡[7]。而FOXF1-AS1是否通過調控miR-146b-3p影響宮頸癌的進展尚不清楚。本實驗旨在研究FOXF1-AS1對宮頸癌細胞增殖凋亡的影響及其機制是否與miR-146b-3p有關。

1 材料與方法

1.1 宮頸癌組織和癌旁組織來源 宮頸癌組織和癌旁組織取自我院2017年5月至2019年12月確診的35例宮頸癌患者，經手術切除癌組織，患者手術前未進行過手術及放化療，患者均知情且同意。

1.2 細胞與主要試劑 宮頸癌細胞SiHa購自上海滬崢生物科技有限公司；RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司；Trizol試劑購自杭州新景生物試劑開發有限公司；SYBR Premix ExTaqTM試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；MTT試劑盒、凋亡檢測試劑盒購自日本同仁研究所；RIPA蛋白裂解液、BCA試劑盒、SDS-PAGE試劑盒購自上海碧云天生物科技公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 細胞處理與分組 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養宮頸癌細胞SiHa，取對數生長期SiHa，將pcDNA、pcDNA-FOXF1-AS1轉染至SiHa中，記為pcDNA組、pcDNA-FOXF1-AS1組；將pcDNA-FOXF1-AS1分別與miR-NC、miR-146b-3p轉染至SiHa中，記為pcDNA-FOXF1-AS1+miR-NC組、pcDNA-FOXF1-AS1+miR-146b-3p組。

1.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測FOXF1-AS1和miR-146b-3p表達水平 提取組織和細胞總RNA，反轉錄成cDNA，按試劑盒說明進行PCR，反應體系：2 μl反轉錄產物、10 μl SYBR Green Mix、上下游引物各0.5 μl，7 μl無菌水；反應條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環；熔解曲線：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。相對表達量用2-△△Ct法計算。FOXF1-AS1和miR-146b-3p分別以GAPDH和U6為內參，FOXF1-AS1上游引物序列：5’-TTCATCGGCTGCGTATTCG-3’，下游引物序列：5’-TTGCCTTCTAGTCGCCTCC-3’；GAPDH上游引物序列：5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’，下游引物序列：5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’；miR-146b-3p上游引物序列：5’-TGAGAACTGAATTCCATAGGCT-3’，下游引物序列：5’-GCACTGTCAGACCGAGACAAG-3’；U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，下游引物序列：5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’。

1.5 MTT檢測細胞增殖 細胞培養至48 h，每孔加入20 μl MTT溶液，孵育4 h，每孔加入150 μl DMSO，振蕩反應10 min，用酶標儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。

1.6 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成數 取對數生長期細胞，制成1×104個/ml細胞懸液，以每孔100個細胞接種于6孔板中，培養2周出現肉眼可見克隆時終止培養，PBS清洗2遍，甲醇固定15 min，吉姆薩染色30 min，在低倍光學顯微鏡下計數>50個細胞的集落。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集細胞，PBS漂洗后用結合緩沖液重懸，加后入10 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI，混勻，避光孵育10 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.8 蛋白質印跡(Western blot)法檢測蛋白表達 用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品經SDS-PAGE、轉膜、封閉后，加入稀釋好的一抗4℃孵育過夜，加入稀釋的HRP標記的二抗，室溫搖床孵育2 h，ECL顯色，暗室下X線膠片顯影、定影。Quantity-One軟件分析蛋白條帶灰度值。蛋白的相對表達量=目的蛋白灰度值/內參GAPDH灰度值。

1.9 雙熒光素酶報告實驗檢測FOXF1-AS1和miR-146b-3p的靶向關系 構建FOXF1-AS1的野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-FOXF1-AS1和MUT-FOXF1-AS1，其分別與miR-NC和miR-146b-3p共轉染至SiHa細胞中；按照說明書檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 FOXF1-AS1在宮頸癌中的表達 與癌旁組織相比，宮頸癌組織中FOXF1-AS1表達水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2 過表達FOXF1-AS1對SiHa增殖的影響 與pcDNA組相比，pcDNA-FOXF1-AS1組FOXF1-AS1表達水平升高，miR-146b-3p表達水平降低，細胞OD值降低，細胞克隆形成數減少(P<0.05)。見表2。

表2 過表達FOXF1-AS1對SiHa增殖的影響

2.3 過表達FOXF1-AS1對SiHa凋亡的影響 與pcDNA組相比，pcDNA-FOXF1-AS1組細胞凋亡率升高，Cleaved-caspase3表達水平升高，pro-caspase3表達水平降低(P<0.05)。見圖1，表3。

圖1 過表達FOXF1-AS1對SiHa凋亡及caspase3蛋白表達的影響(A 過表達FOXF1-AS1對SiHa凋亡的影響；B 過表達FOXF1-AS1對caspase3蛋白表達的影響)

表3 過表達FOXF1-AS1對SiHa凋亡的影響

2.4 FOXF1-AS1靶向miR-146b-3p Starbase預測顯示FOXF1-AS1與miR-146b-3p具有結合位點；與miR-NC組相比，miR-146b-3p轉染WT-FOXF1-AS1的細胞熒光素酶活性降低(P<0.05)。見圖2，表4。

表4 雙熒光素酶報告實驗

圖2 FOXF1-AS1靶向miR-146b-3p

2.5 miR-146b-3p能逆轉過表達FOXF1-AS1對SiHa增殖凋亡的影響 與pcDNA-FOXF1-AS1+miR-NC組相比，pcDNA-FOXF1-AS1+miR-146b-3p組細胞OD值升高，克隆形成數增多，細胞凋亡率降低，Cleaved-caspase3表達水平降低，pro-caspase3表達水平升高(P<0.05)。見圖3，表5。

圖3 miR-146b-3p能逆轉過表達FOXF1-AS1對SiHa凋亡及caspase3蛋白表達的影響(A miR-146b-3p能逆轉過表達FOXF1-AS1對SiHa凋亡的影響;B miR-146b-3p能逆轉過表達FOXF1-AS1對caspase3蛋白表達的影響)

表5 miR-146b-3p能逆轉過表達FOXF1-AS1對SiHa增殖凋亡的影響

3 討論

目前宮頸癌治療方式主要還是以手術為主，放化療為輔；腫瘤精準治療的提出表明了靶向性，精準化個性靶向治療是今后宮頸癌臨床治療的大方向[8,9]。研究表明lncRNA在腫瘤的發生發展中占重要作用，FOXF1-AS1在肺腺癌中表達降低，其表達與單獨的總體生存相關，是一種新的潛在診斷、預后生物標志物[10]。FOXF1-AS1在非小細胞肺癌中作為腫瘤抑制因子起作用[11]。而有研究報道FOXF1-AS1在骨肉瘤組織和細胞系中上調表達，沉默FOXF1-AS1通過降低MMP-2和MMP-9的表達在體內外顯著抑制細胞增殖，遷移，侵襲和腫瘤生長[12]。以上研究表明FOXF1-AS1在不同腫瘤中可能起不同作用。本實驗結果顯示，宮頸癌組織中FOXF1-AS1表達水平顯著低于癌旁組織；過表達FOXF1-AS1后，SiHa細胞中miR-146b-3p表達水平降低，細胞OD值降低，細胞克隆形成數減少，細胞凋亡率升高，Cleaved-caspase3表達水平升高，pro-caspase3表達水平降低；表明過表達FOXF1-AS1可能抑制宮頸癌SiHa細胞增殖，促進細胞凋亡。

有研究表明下調miR-146b-3p可抑制宮頸癌細胞的增殖，遷移[6]。且研究報道miR-146b-3p在非小細胞肺癌患者外周循環血中呈顯著過表達，可用作早期非小細胞肺癌的診斷標志物[13]。circ_0071662通過使miR-146b-3p變海綿抑制膀胱癌細胞的增殖和侵襲[14]。miR-146b-3p在甲狀腺癌組織和細胞系中高表達，增強乳頭狀甲狀腺癌細胞的侵襲和轉移[15]。本實驗結果顯示，FOXF1-AS1可靶向調控miR-146b-3p，且miR-146b-3p可逆轉過表達FOXF1-AS1對SiHa增殖、凋亡的影響。提示，FOXF1-AS1可能通過調控miR-146b-3p表達抑制SiHa增殖，促進SiHa凋亡。

綜上所述，過表達FOXF1-AS1可能通過下調miR-146b-3p抑制宮頸癌SiHa細胞增殖，促進細胞凋亡。