T細胞中Tim-3異常表達對胃癌進展的調控機制

郭艷 魏小娟 高琦

(新鄉市中心醫院消化內科，河南 新鄉 453000)

胃癌是發生于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，發病率居全球惡性腫瘤第4位，死亡率居全球惡性腫瘤第2位〔1〕。目前臨床對胃癌患者多采用根治性手術聯合放化療的綜合治療方案，能夠改善患者臨床癥狀，縮小原發病灶，降低腫瘤分期，減緩腫瘤進展速度，但胃癌易復發轉移，患者遠期生存時間仍較短〔2〕。因此研究胃癌發生、發展的相關因素，尋找新的有效治療方案，對提升患者預后有重要意義。有研究發現〔3〕免疫系統在腫瘤控制中具有重要作用，免疫系統失衡會促進腫瘤病情進展。T細胞免疫球蛋白黏蛋白(Tim)-3是在某些T細胞亞類表達的免疫調控分子，能夠介導細胞免疫耐受〔4〕。有研究顯示〔5〕Tim-3在胃癌組織T細胞中異常表達并與胃癌發生相關，但T細胞中Tim-3異常表達對胃癌進展的影響機制尚未明確。本研究就T細胞中Tim-3異常表達對胃癌進展的調控機制進行探討。

1 資料與方法

1.1一般資料 前瞻性選擇2018年5月至2019年5月新鄉市中心醫院收治的107例胃癌患者，收集其手術切除的胃癌組織及癌旁正常組織。107例胃癌患者中，男71例，女36例；年齡60～80〔平均(67.68±5.13)〕歲。納入標準：①胃癌經病理活檢確診〔1〕；②入院前未接受任何抗胃癌治療。排除標準：①病歷資料不完整；②合并重要臟器功能不全、糖尿病、高血壓、過敏性疾病、自身免疫系統疾病、感染性疾病、心腦血管疾病、精神系統疾病、血液系統疾病、其他惡性腫瘤；③依從性不好，不能配合完成本研究。

1.2研究方法

1.2.1采用流式細胞術檢測胃癌組織及癌旁正常組織CD4+T細胞中Tim-3表達水平 收集其手術切除的胃癌組織及癌旁正常組織，磷酸鹽緩沖液(PBS)，上海廣銳生物科技有限公司)清洗，剪碎，用RPMI-1640培養液(杭州吉諾生物醫藥技術有限公司)調整體積為50 ml，加入終濃度為0.002%Ⅰ型DNA酶(上海聯邁生物工程有限公司)、0.1%Ⅳ型膠原酶(上海群己生物科技有限公司)、0.01%透明質酸酶(上海樊克生物科技有限公司)，連續磁力攪拌3～4 h，用100目鋼網過濾，收集100 μl單細胞懸液，采用離心機(上海知正離心機有限公司，型號：GQ145)，3 000 r/min離心20 min，棄上清，PBS重懸細胞，加至Ficoll離心管(北京索萊寶科技有限公司)內，2 500 r/min離心10 min，吸取中間單個核細胞，PBS重懸細胞，向各管中加入Tim-3-PE/CD4-FITCmAb(北京孚博生物科技有限公司)及相應的同型對照抗體(北京博蕾德生物科技有限公司)進行標記，4℃避光30 min，2 500 r/min離心15 min，棄上清，采用流式細胞儀(深圳市達科為生物技術股份有限公司，型號：EXFLOW-206)檢測胃癌組織及癌旁正常組織CD4+T細胞中Tim-3表達水平。

1.2.2分組及處理 將胃癌AGS細胞(上海生博生物醫藥科技有限公司)分為空白對照組、陰性對照組、Tim-3過表達組，進行原代培養，待細胞融合度達80%時，細胞消化、傳代，取對數生長期的胃癌AGS細胞，以5×106個/孔接種于6孔細胞培養板中，用含10%胎牛血清(上海覓拓生物科技有限公司)的DMEM培養基(上海博湖生物科技有限公司)，于37℃、5% CO2培養箱(廣州南方生化醫學儀器有限公司，型號：SCO2W-2)培養，待細胞融合度達90%時，空白對照組不作任何處理，陰性對照組轉染10 μg pEGFP-N1質粒(上?？吕咨锟萍加邢薰?，Tim-3過表達組轉染10 μg pEGFP-N1-Tim-3質粒(武漢維克賽思科技有限公司)，轉染結束繼續培養48 h。所有轉染操作按照北京嘉美臻元生物技術有限公司的LipofectamineTM2000轉染說明書進行。

1.2.3采用CCK8法檢測各組胃癌AGS細胞增殖能力 取轉染后的各組胃癌AGS細胞，接種于6孔細胞培養板中，細胞接種密度為2×103個/孔，每孔加入100 μl細胞懸液，待細胞貼壁生長后每孔加入10 μl CCK-8溶液(南京恩晶生物科技有限公司)，37℃孵育2 h，采用酶標儀(大連華洋分析儀器有限公司，型號：CD MICROPLATE READER)測定480 nm波長處各孔光吸收值(OD)，計算胃癌AGS細胞增殖率=(處理組OD/對照組OD)×100%。

1.2.4采用Transwell小室侵襲實驗檢測各組胃癌AGS細胞侵襲能力 取轉染后的各組胃癌AGS細胞制成細胞懸液，在Transwell小室的上室鋪入基質膠(北京拜爾迪生物技術有限公司，60 μl/孔)，然后加入細胞懸液(1×105個細胞)，200 μl/孔，在Transwell小室的下室加入600 μl DMEM培養液，37℃孵育24 h，24 h后棄上室液體，4%多聚甲醛溶液(上海源葉生物科技有限公司)固定細胞，風干，0.1%結晶紫(臨沂艾澤拉斯生物科技有限公司)染色，PBS漂洗，于熒光顯微鏡(上海千欣儀器有限公司，型號：Ts2R)下觀察并計算穿過小室膜的平均細胞數，以此表示胃癌AGS細胞侵襲能力。

1.2.5采用Western印跡檢測各組胃癌AGS細胞中Tim-3、Wnt3、β-catenin表達水平 取轉染后的各組胃癌AGS細胞，勻漿，裂解，離心，提取蛋白，使用BCA試劑盒(南京卡米洛生物工程有限公司)對蛋白進行定量，取總蛋白上樣，電泳，切膠，轉膜，封閉，加入1∶200稀釋的兔抗Tim-3單克隆抗體(南京金斯瑞生物科技有限公司)、1∶400稀釋的兔抗Wnt3單克隆抗體(上?？道噬锟萍加邢薰?、1∶500稀釋的兔抗GAPDH單克隆抗體(武漢艾美捷科技有限公司)，4℃孵育過夜，洗膜，加HRP標記山羊抗兔二抗(廈門研科生物技術有限公司)，37℃孵育60 min，洗膜，ECL發光試劑盒(武漢巴菲爾生物技術服務有限公司)顯色，洗片后顯影、定影，以GAPDH為內參蛋白，分析各組胃癌AGS細胞中Tim-3、Wnt3、β-catenin表達水平。

1.3統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1胃癌組織及癌旁正常組織CD4+T細胞中Tim-3表達水平 胃癌組織CD4+T細胞中Tim-3表達水平〔(16.25±7.36)%〕顯著高于癌旁正常組織〔(5.71±1.88)%；t=14.353,P<0.001〕。

2.2各組胃癌AGS細胞增殖能力、侵襲能力 Tim-3過表達組胃癌AGS細胞增殖能力、侵襲能力明顯高于空白對照組、陰性對照組(P<0.05)；陰性對照組胃癌AGS細胞增殖能力、侵襲能力較空白對照組無顯著差異(P>0.05)，見表1、圖1。

表1 各組胃癌AGS細胞增殖能力、侵襲能力

圖1 各組胃癌AGS細胞侵襲能力(結晶紫，×100)

2.3各組胃癌AGS細胞中Tim-3、Wnt3、β-catenin表達水平 Tim-3過表達組胃癌AGS細胞中Tim-3、Wnt3、β-catenin表達水平明顯高于空白對照組、陰性對照組(P<0.05)；陰性對照組胃癌AGS細胞中Tim-3、Wnt3、β-catenin表達水平較空白對照組無顯著差異(P>0.05)，見圖2、表2。

圖2 各組胃癌AGS細胞中Tim-3、Wnt3、β-catenin表達水平

表2 各組胃癌AGS細胞中Tim-3、Wnt3、β-catenin表達水平

3 討 論

胃癌為一種常見消化道惡性腫瘤，主要由幽門螺桿菌(Hp)感染、不良飲食習慣、不良生活方式、環境污染等因素所致，早期胃癌癥狀不具備特異性，通常表現為惡心、嘔吐、上腹不適等類似胃炎或胃潰瘍的上消化道癥狀，不能引起患者重視，隨著腫瘤生長，如腫瘤破壞血管，可有嘔血、黑便等消化道出血癥狀，如腫瘤侵犯胰腺被膜，可出現腰背部持續疼痛，如癌細胞發生遠處淋巴結轉移，可觸及腫大淋巴結〔6〕。根治性手術、放射性治療、化學藥物治療等相互配合的綜合治療方案對胃癌患者具有一定療效，但胃癌易復發轉移，患者多預后不良。

胃癌發生是一個多因素、多基因、多步驟、多階段的過程，腫瘤免疫逃逸是導致胃癌發生的重要因素之一，而腫瘤免疫逃逸與T細胞關系密切〔7〕。T細胞是淋巴細胞的主要組分，能夠直接殺傷靶細胞，促進特異性抗原的免疫應答反應、輔助或抑制B細胞產生抗體，抑制腫瘤形成〔8〕。Tim-3是在某些T細胞亞類表達的免疫調控分子，能夠調節輔助性T細胞(Th)1免疫應答，介導細胞免疫耐受〔9〕。Tim-3基因位于5號染色體5q33.2，由301個氨基酸組成，結構上包含胞內區、跨膜區、免疫球蛋白樣區、黏蛋白樣區〔10〕。有研究顯示在T細胞上高表達的Tim-3會導致T細胞功能紊亂〔11〕。另有研究顯示Tim-3與其配體半乳糖凝集素(Galectin)-9的相互作用能夠參與免疫系統負性調節，在抗腫瘤免疫及過敏性皮炎(AD)、過敏性鼻炎(AR)等過敏性疾病和系統性紅斑狼瘡(SLE)、多發性腦脊髓硬化癥(MS)等自身免疫性疾病中發揮重要作用〔12〕。既往研究報道阻斷Tim-3信號通路后能夠部分恢復T細胞的抗腫瘤活性〔13〕。臨床數據顯示Tim-3在胃癌組織CD4+T細胞上和CD8+T細胞上均呈高表達，其表達水平與胃癌患者臨床分期、淋巴結轉移、組織分化程度相關〔14〕。本研究顯示胃癌組織CD4+T細胞中Tim-3表達水平顯著高于癌旁正常組織，這與上述研究〔14〕結果一致，提示Tim-3在胃癌患者CD4+T細胞中呈高表達，Tim-3可能與胃癌發生有關。

本研究選用胃癌AGS細胞作為研究材料，分析Tim-3高表達對胃癌進展的影響，發現Tim-3高表達能夠促進胃癌進展。隨著臨床基礎研究的不斷深入，與膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等惡性腫瘤發生、發展有密切聯系的Wnt/β-catenin信號通路逐漸受到廣大學者的關注。Wnt/β-catenin信號通路是調控細胞生長、分化的關鍵途徑，在腫瘤干細胞(CSCs)分化及成瘤中發揮重要作用〔15〕。Wnt3為Wnt/β-catenin信號通路中的一種重要蛋白，可與細胞膜受體蛋白卷曲蛋白(FZD)、散亂蛋白(Dsh)相互作用，使β-catenin在細胞質內異常聚集，從而調節其下游基因轉錄〔16〕。本研究提示Tim-3高表達可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進胃癌細胞增殖、侵襲，從而促進胃癌進展，這可為胃癌免疫治療提供新的方向。

綜上所述，Tim-3在胃癌患者CD4+T細胞中呈高表達，Tim-3高表達可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進胃癌細胞增殖、侵襲，從而促進胃癌進展。但Tim-3對胃癌進展的調控機制是否還有其他，有待進一步研究。