植物乳桿菌發酵對小米風味物質的影響

陳忠恕，王曉聞

(山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801)

小米，又名粟米，具有生育期短、適應性強且不易腐敗的特點。山西省素有“小雜糧王國”的美稱，有數據顯示，在2014年之后，山西省擁有全國最大的小米種植面積；在2017年達到311.8萬畝，約占全國小米種植面積的1/7，總產量占全國的1/3(58.7萬噸)[1]。小米是一種優質的藥食同源雜糧，具有很高的營養價值和功能特性。《本草綱目》中這樣描述小米：“治反胃熱痢，補虛損，開腸胃”[2]。古書《靈柩經》則認為小米除“補氣、養胃”這些功能外，還能預防和治療某些婦科疾病[3]。現代中醫研究發現，小米有清熱解毒、健胃安眠的功效，能夠成為孕婦和傷病患者在康復過程中以及嬰幼兒在斷乳食期的主要食物之一[4]。

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)是一類革蘭氏陽性、兼性異型發酵乳酸菌，呼吸方式為厭氧或兼性厭氧，是被廣泛應用于食品中的益生菌之一且極耐酸[5-6]和膽鹽[7-8]，因此在運用搭配食品及加工中發揮了巨大的作用，如發酵酸奶、泡菜及肉類等。發酵食品擁有其獨特的風味，同時也是讓益生菌進入體內的良好方式。植物乳桿菌能夠增強人體免疫力[9-10]；調節人體腸道菌群[11]；吸附有害物質，如鉛[12]、鎘[13]和鋁[14]。

植物乳桿菌還能清除塑化劑[15]、展青霉素。

頂空氣相色譜-離子遷移譜聯用技術(gas chromatography-ion mobility spectroscopy，GC-IMS)是一項新興檢測手段，于大氣壓下就能開始檢測。在氣相色譜和離子迀移譜綜合運用下，對得到的化學信息及測定特征對比能得到更好的結果[16]。目前，GC-IMS技術在食品中的應用主要是在食品的安全控制及過程分析等方面，如檢測摻假油樣[17]、綠茶品種[18]、茶葉質量[19]及區分白酒香型[20]等。但利用GC-IMS檢測小米粉發酵過程中的風味物質變化的研究鮮有報道。

本研究以植物乳桿菌發酵制得發酵0，12，24，36，48，60，72 h的小米粉，利用GC-IMS技術測定不同時間其揮發性成分，利用與儀器配套的分析軟件Vocal對物質進行定性分析；利用插件Reporter建立三維圖譜、二維俯視圖譜；利用Gallery Plot插件建立指紋圖譜；通過HemI軟件建立熱圖進行聚類分析；通過SIMCA 14.1對樣品進行偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)；利用OriginPro 2019處理PLS-DA得到的樣品VIP值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小米(晉谷21號)：產自山西省晉中市太谷區；植物乳桿菌(CICC20265)：由山西農業大學食品科學與工程學院提供。

1.2 試驗試劑

高溫α-淀粉酶(食品級)、糖化酶、MRS肉湯：均由北京索來寶科技有限公司提供。

1.3 試驗儀器

BS210S電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；HSJ-4恒溫水浴攪拌器 江蘇科析儀器有限公司；QJ-06磨粉機 上海東華高壓均質機廠；YSQ-LS-S高壓滅菌鍋、BJ-ICD無菌操作臺 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SCIENTZ-18N真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；DHP-500恒溫培養箱 北京永光明醫療儀器廠；Flavour Spec?風味分析儀 德國G.A.S公司；CTC-PAL自動頂空進樣器 瑞士CTC Analytics公司；SE-54毛細管柱 德國CS-Chromatographie Service設備供應商。

1.4 試驗方法

1.4.1 小米預處理

取潔凈的小米籽粒于研磨機中充分研磨，過80目篩備用。

1.4.2 菌種活化

取配制好的MRS培養基10 mL于試管中，121 ℃滅菌15 min。在無菌操作臺上用接菌環挑取少量乳酸菌菌粉置于培養基中振蕩混合，37 ℃恒溫培養24 h(活化好的乳酸菌菌液呈現渾濁狀態)。

將試管中活化好的乳酸菌菌液接入裝有100 mL培養基的錐形瓶中，37 ℃恒溫培養24 h。以同樣步驟再進行兩次擴大培養試驗，最后一次擴大培養的菌液放到4 ℃冰箱中儲存。

1.4.3 小米粉的糊化、糖化、液化

糊化：取20 g小米粉，按1∶10料液比于紫外照射下浸泡12 h后加熱50 min至80 ℃。

液化：在糊化后的料液中加入高溫α-淀粉酶18 U/g，80 ℃加熱60 min。

糖化：在液化后的料液中加入糖化酶180 U/g，50 ℃加熱60 min。

1.4.4 發酵試驗

按3%(W/W)添加發酵劑，設0(空白)，12，24，36，48，60，72 h 7組樣品，凍干成粉并在-18 ℃下保存待測。

1.4.5 風味分析儀測定

1.4.5.1 樣品處理

取發酵完成的各小米粉樣品各1 g，置于20 mL頂空瓶中，80 ℃孵育15 min后進樣100 μL。

1.4.5.2 GC條件

設置氣相色譜柱溫度為 60 ℃，測定過程中的載氣為高純N2；載氣流速為小米粉風味物質分離最適流速：初流速為2 mL/min，保持20 min，然后升至 100 mL/min，保持10 min，總分析時間為30 min。

1.4.5.3 IMS檢測條件

設置IMS漂移管溫度為45 ℃，測定過程中的漂移氣為高純N2，漂移氣的流速保持在150 mL/min不變；漂移管內的電離源為氘放射，即β射線，離子化模式為正離子模式。

1.5 數據處理

利用與儀器配套的分析軟件Vocal對物質進行定性分析；利用插件Reporter建立三維圖譜、二維俯視圖譜；利用Gallery Plot插件建立指紋圖譜；通過HemI軟件建立熱圖進行聚類分析；通過SIMCA 14.1對樣品進行偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)；利用OriginPro 2019處理PLS-DA得到的樣品VIP值。

2 結果與分析

2.1 不同發酵時間小米粉樣品中VOCs的定性

樣品經過氣相色譜分離，然后基于保留時間和遷移時間通過離子遷移譜分析。檢測出的小米發酵粉揮發性成分的定性分析以圖1中的編號表示，縱坐標為保留時間，橫坐標為遷移時間。GC-IMS共檢測出50個信號峰，通過軟件內置的NIST GC數據庫及G.A.S的IMS數據庫，確定了40種揮發性成分，一共包括12種醛類、10種醇類、6種酮類、11種酯類和1種呋喃類物質，鑒定出的組分見表1，包括化合物名稱、CAS號、分子量、保留指數、保留時間、遷移時間。其他有信號峰但無法檢測出的VOCs未列出。當穿過遷移區域時，由于分析的離子和中性分子之間形成聚合物(如二聚體和三聚體)，因此某些VOCs[21]檢測到多個信號峰。由于單體和二聚體的存在，戊醛、己醛、反式-2-戊烯醛反式-2-庚烯醛、丁醇、1-戊醇、正己醇、反式-2-己烯-1醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丁酸丙酯、己酸乙酯均表出雙峰。

圖1 不同發酵時間的小米粉離子遷移譜圖譜Fig.1 Ion migration spectra of millet flour at different fermentation time

表1 小米粉中檢測出的VOCs信息Table 1 The VOCs information detected in millet flour

續 表

2.2 不同發酵時間小米粉揮發性成分三維譜圖差異分析

圖2 不同發酵時間的小米粉中VOCs成分三維譜圖Fig.2 Three-dimensional spectra of VOCs in millet flour at different fermentation time

為了便于直觀地觀察和比較，采用三維譜圖對不同小米粉在不同發酵時間產生的VOCs進行了表征。由圖2可明顯看出，隨著發酵時間的增大，一些VOCs的含量降低，形成新的物質。其中，A部分的峰高在0～36 h內持續降低，48 h出現新的峰高，然后又降低。B部分的峰高隨著發酵時間的增加不斷降低。而在C部分可以觀察出小米粉發酵后比0 h的小米粉樣品出現了很多新的峰值，由此斷定小米粉在植物乳桿菌發酵的影響下產生了新的風味物質且可能主要集中在這個保留時間和遷移時間段，由于此處的信號峰較為密集，不易判斷和分析，因此利用俯視圖作不同發酵時間的差異對比(見圖3)。

2.3 不同發酵時間小米粉揮發性成分二維俯視譜圖差異分析

圖3 小米粉不同發酵時間的二維譜圖Fig.3 Two-dimensional spectra of millet flour at different fermentation time

由于三維譜圖能觀察到VOCs信號峰出現的位置，但如果出現信號峰分布比較密集的情況，不利于觀察比較樣品間的差異，且信號峰之間的峰高差異不顯著，因此利用二維俯視圖進行比較，見圖3。橫坐標1.0處的線是反應離子峰(reaction ion peak,RIP)。RIP峰兩側的每個點分別為一種揮發性有機物，顏色越深表示此化合物濃度越高[22]。以發酵0 h的小米粉為參照，對比其他樣品中所有的揮發性物質的差異。可以觀察小米粉所含的VOCs主要集中在遷移時間100～300 ms之間，且與發酵0 h的小米粉相比，在此保留時間范圍內，VOCs有明顯變化。這一發現表明，小米粉在乳酸菌發酵的作用下生成了小米粉自身不含的揮發性物質且本身含有的某些揮發性物質含量降低。

2.4 不同發酵時間小米粉揮發性有機化合物指紋圖譜分析

圖4 小米粉樣品揮發性化合物的指紋譜圖Fig.4 Fingerprint spectra of volatile compounds in millet flour samples

雖然三維及二維譜圖能體現出小米粉樣品在發酵過程中的變化趨勢，但很難對圖中密集區域的VOCs作出準確的判斷分析，而指紋譜圖很好地解決了這個問題。以三維譜圖的峰值信號，形成的小米粉樣品揮發性化合物的指紋譜圖(見圖4)，每一行代表一個樣品的全部信號峰，每一列代表不同樣品中的同一VOCs。指紋譜圖上的每個點代表一種VOC的含量，點的顏色越亮，說明該VOC在此樣品中的含量越高。指紋圖譜中名稱相同的兩種化合物為單體及其二聚體。二聚體的質子親和力強及含量的增多使它們的遷移時間增長。通過指紋譜圖能夠直觀地比較不同樣品之間的VOCs種類及含量的區別，揭示了小米粉在發酵過程中各VOCs的動態變化。指紋譜圖上的數字代表了未定性揮發性物質。對比整個發酵過程，小米粉中的VOCs含量有明顯的變化，這是基于植物乳桿菌生長代謝過程中利用小米粉中的營養物質產生的代謝物導致的，同時使小米粉具有了特殊的風味。

小米粉的VOCs在發酵過程中不斷發生變化，通過比較VOCs在不同階段的譜點強度，可以確定該物質在發酵過程中的變化(增加、減少、消失或波動)。圖4中A區域內的VOCs在0 h時含量豐富，但在發酵之后含量急劇減少甚至消失，有壬醛、正庚醛、正己醛、正戊醛、正戊醇、庚醇、正丁醇、丁酸丙酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯及甲酸乙酯，這些物質是小米粉自身的風味物質，可能在植物乳桿菌生長代謝過程中被降解或者轉化成其他的VOC物質。B區域中的3-羥基-2-丁酮、丙酮酸乙酯及兩種未檢測出的VOCs含量在發酵過程中不斷增大。C區域的VOCs含量在發酵24 h達到最高值且在36 h減少而48 h時有一定上升趨勢，總體在發酵過程中含量呈波動趨勢，如反式-2-庚烯醛、反式-2-辛烯醛、正丙醇、己酸乙酯及編號為2，5，7的未檢測出的VOCs。而反式-2-己烯-1-醇、反式-2-戊烯醛、2-丁酮、2-戊基呋喃、甲基庚烯酮、環己烯-2-酮、正己醇、2-庚酮在12 h時含量最大，隨著發酵時間的增長不斷減少。綜合已檢測出的VOCs，通過指紋圖譜初步判斷，雖然小米粉中2-庚酮、己醇、環己烯-2-酮、甲基庚烯酮、2-戊基呋喃、2-丁酮、反式-2-戊烯醛、反式-2-己烯-1-醇的含量在12 h達到最高值，但在發酵24 h后仍有較高含量，而3-羥基-2-丁酮和丙酮酸乙酯在發酵24 h后也已有較高含量且3-羥基-2-丁酮具有令人愉快的奶油香味；丙酮酸乙酯具有新鮮甜潤的花果香氣，不難看出在發酵24 h時風味物質含量最高且種類最豐富，可能在發酵24 h時小米粉樣品的感官最佳。

2.5 基于熱圖對不同發酵時期的小米粉樣品聚類分析

為了進一步分析小米在發酵過程中VOCs的差異，將不同樣品中的VOCs含量作熱圖進行聚類分析，見圖5。

圖5 不同發酵時間的小米粉熱圖及聚類分析Fig.5 Heat map and cluster analysis of millet flour at different fermentation time

由圖5可知，所有樣品可以分為發酵0 h的樣品和其他發酵時間的樣品兩大類，因此可以說明植物乳桿菌發酵對小米粉的VOCs含量產生了巨大的影響。同時，發酵48 h和發酵60 h的樣品、發酵36 h和發酵72 h的樣品聚集到一起，說明它們之間的VOCs具有一定的相似度，發酵12 h的樣品又和48 h及60 h的樣品有一定的相似度，24，36，72 h的樣品有一定的相似度，說明小米粉在發酵過程中VOCs含量的變化是不斷波動的，此發現與指紋譜圖結論一致。

2.6 小米發酵粉樣品的PLS-DA分析

目前多數對GC-IMS結果的分析方法采用PCA主成分分析法[23-25]，PCA可以清晰明了地展示數據組內的重復性和組間的差異性，評估數據的可重復性，發現可能存在的異常值，比如明顯離群的樣本點。但PCA是一種無監督的模式，屬于探索性分析。由于樣品間VOCs含量數據的復雜性，對于組間差異不夠明顯的樣品，單純的無監督分析不能很好地區分樣本的組間差異，PLS-DA是有監督的模式，屬于模型的方法，使用偏最小二乘回歸建立VOCs表達量與樣品之間的關系模型，對數據降維，這種監督模式通常可以更好地確立樣本關系。

經PLS-DA分析，R2X=0.995，R2Y=0.978，Q2=0.919，R2X和R2Y分別表示模型所能解釋X和Y矩陣信息的百分比，R2X-R2Y<0.3代表該模型較可靠。使用置換檢驗的方法對PLS-DA進行驗證，次數為200次，得到檢驗統計量來評估模型擬合的質量。PLS-DA置換檢驗結果見圖6，右側是原始值，左側是模擬值，所有左側的R2值和Q2值均比右側低，R2和Q2的回歸線斜率大于1，且Q2的回歸線截距為負值，說明該模型穩定性較好，未出現過擬合現象，具有較好的預測能力[26]。

圖6 小米粉樣品PLS-DA得分圖Fig.6 PLS-DA score scatter plot of millet flour samples

由圖6可知，發酵不同時間段的小米粉樣品通過PLS-DA得到了較好的區分，且發酵0 h的小米粉樣品與其他樣品表現出巨大差異，且發酵36 h的樣品與發酵72 h的樣品距離較近，24 h的樣品與36 h及72 h的樣品距離較近，表現出較高的相似度，與聚類分析結果一致。

圖7 模型置換檢驗圖Fig.7 Model permutation test diagram

圖8 小米粉樣品中不同VOCs的VIP得分圖Fig.8 VIP score plot of different VOCs in millet flour samples

變量投影重要度(variable importance for the projection, VIP)表征了分類過程中各個變量的重要性，通常VIP值大于1的變量在不同樣本組(即不同發酵時間的小米粉樣品)之間的區分中起著重要作用。通過VIP值篩選出15個差異標記物：己酸乙酯二聚體、乙酸乙酯二聚體、正丙醇、己酸乙酯、3-羥基丁烷-2-酮、2-庚酮、反式-2-庚烯醛、正己醛二聚體、反式-2-庚烯醛二聚體、苯甲醛、正己醇二聚體、反式-2-戊烯醛、正丁醇二聚體及編號為1和10的兩種未鑒定的VOCs，這些VOCs的VIP值較高，說明這些物質在小米粉的發酵過程中含量變化顯著。

3 結論

此研究首次采用GC-IMS技術研究小米粉在發酵過程中的風味變化情況，無需復雜的前處理及萃取過程，充分利用了GC高分離效率和IMS高靈敏度的特點，將數據以可視化的形式呈現在譜圖中，不同發酵時間的樣品呈現出的差異更加直觀顯著。以GC-IMS數據庫為依據,通過離子遷移譜圖和遷移時間及保留時間，建立了定性表格對分離出的VOCs進行定性，得知發酵小米粉樣品中共分離出28種揮發性物質，包括醛類、醇類、酮類、酯類和呋喃類。通過對比小米發酵粉樣品的三維及二維譜圖，可以得知小米粉發酵前后的VOCs差異較大，且大部分集中在保留時間100～300 ms之間。為了更直觀地分析小米粉樣品中的VOCs，建立了指紋圖譜，由指紋圖譜可知，樣品中含有的VOCs隨著發酵時間的改變不斷改變，其中壬醛、正庚醛、正己醛、正戊醛、正戊醇、庚醇、正丁醇、丁酸丙酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯及甲酸乙酯在0 h時含量最高，發酵過后基本消失，3-羥基-2-丁酮、丙酮酸乙酯及兩種未檢測出的VOCs含量在發酵過程中不斷增大，其他VOCs在發酵過程中的含量變化呈波動趨勢。綜合指紋譜圖結果分析得到在24 h時，小米粉樣品的風味物質含量最高且豐富，或擁有花果及奶油等香味，理論上達到對比其他樣品的感官最佳值，與上前述結果一致。聚類分析結果顯示，發酵48 h和發酵60 h的樣品相似度高，且這兩個樣品與發酵12 h的樣品有一定相似度，發酵36 h和發酵72 h的樣品相似度高，且發酵24 h的樣品和這兩個樣品有一定的相似度，此發現能以側面反映發酵過程中某些VOCs含量處于不斷變化的狀態；所有的樣品都與發酵0 h的樣品有較大差異，說明植物乳桿菌發酵對小米粉的VOCs成分有巨大影響，與指紋譜圖分析結果一致。由PLS-DA分析可得，R2X-R2Y=0.017<0.3說明模型可靠。置換分析結果說明模型未過擬合，通過PLS-DA得分圖可知，0 h的小米粉樣品與其他樣品差異巨大，發酵36 h與發酵72 h的樣品相似度較高，24 h與36 h及72 h的樣品相似度較高，與聚類分析結果一致。通過VIP得分圖篩選出15個差異標記物：己酸乙酯二聚體、乙酸乙酯二聚體、正丙醇、己酸乙酯、3-羥基丁烷-2-酮、2-庚酮、反式-2-庚烯醛、正己醛二聚體、反式-2-庚烯醛二聚體、苯甲醛、正己醇二聚體、反式-2-戊烯醛、正丁醇二聚體及編號為1和10的兩種未鑒定的VOCs在小米粉整個發酵過程中的變化最為明顯。但由于GC-IMS技術起步較晚，手段較新，IMS數據庫不夠完善，部分VOCs無法進行定性，無法定性的VOCs之后可以利用其他分析技術進行驗證，完善小米發酵領域的VOCs數據庫。

本研究通過探究小米粉在發酵過程中風味物質的變化，以期在小米產品加工上提供新的思路，開發出擁有優質風味和良好營養的小米發酵制品，同時證明了GC-IMS檢測技術能夠高效準確地鑒別出不同發酵時間段的發酵小米粉樣品，為鑒別不同工藝條件發酵的小米粉提供新的思路，有望成為新的谷物發酵工藝優化檢測的新技術。