涪陵青菜頭泡菜發酵過程中的細菌多樣性分析

任亭，劉玉凌，彭玉梅，曾勝，賀云川，欒興霞，羅遠莉*

(1.重慶市渝東南農業科學院，重慶 408000；2.重慶市涪陵榨菜集團股份有限公司，重慶 408000)

我國泡菜歷史悠久，屬四川泡菜最為有名，已成為西南地區餐桌上常見的配菜。由于泡菜在泡制過程中蔬菜原料一直處于常溫下，且以乳酸菌發酵為主，在較好保存蔬菜原料維生素、礦物質等營養物質的同時也擁有大量益生菌，使其具有抑制腸道致病菌、抑菌、抗癌等多種功效[1-2]。泡菜從發酵開始到成熟是一個極為復雜的微生物發酵系統，其菌落結構與發酵條件、發酵底物、制作工藝均有著較大聯系。有研究報道，泡菜食鹽濃度對乳酸菌多樣性有一定影響，低鹽濃度泡菜中乳酸菌多樣性高于高鹽泡菜[3]。朱琳等[4]發現蘿卜泡菜發酵過程中細菌群落結構多樣性伴隨著亞硝酸鹽濃度變化也發生演替。康建依等[5]研究表明山西地方自然發酵蔬菜在發酵前期細菌多樣性豐富，發酵中后期，細菌多樣性降低，其主要菌屬為乳桿菌屬(Lactobacillus)。

青菜頭是重慶市涪陵區特產蔬菜，當地農戶喜好用其制作泡菜。青菜頭泡菜具有脆嫩爽口、風味鮮美、營養豐富等特點。目前，采用高通量測序技術對青菜頭泡菜中微生物菌群結構的研究尚未見報道。本研究以青菜頭為泡菜原料，當地陳年泡菜水為母水制作泡菜，分析研究其發酵過程中泡菜品質、微生物菌落的動態變化，在明確青菜頭泡菜品質特性的同時更全面地了解青菜頭泡菜發酵過程中的微生物多樣性，為青菜頭泡菜產品的研發與生產提供了理論支撐，同時為泡菜發酵優良菌株的分離鑒定提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

泡菜原料：鮮青菜頭、食鹽、大蒜、鮮姜、辣椒、花椒，購于重慶涪陵某菜市場。

陳年泡菜母水：重慶市涪陵區二度村某農戶。

1.2 青菜頭泡菜的制備

青菜頭清洗瀝干水分后切塊，按青菜頭∶泡菜母水∶涼開水(鹽濃度4%)為2∶1∶4的比例入壇，再添加冰糖、姜、大蒜、辣椒、花椒，于25 ℃密封發酵。在發酵第0，1，3，5，7，9天取泡菜水進行各項指標的檢測。

1.3 微生物指標測定方法

參照GB 4789.35-2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》、GB 4789.2-2016《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》。

1.4 理化指標測定方法

1.4.1 pH值、總酸含量的測定

pH值采用pH計測定，總酸參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》。

1.4.2 亞硝酸鹽含量的測定

參照國標GB 5009.33-2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》。

1.4.3 樣品總DNA提取、PCR擴增

采用細菌基因組DNA抽提試劑盒提取樣品總DNA，提取步驟根據說明書進行。擴增結束后，PCR 擴增產物使用2%瓊脂糖進行凝膠電泳檢查擴增效果。

1.4.4 高通量測序分析

將樣品的PCR產物送至重慶博愛麥迪遜生物科技公司，在Illumina-HiSeq平臺上進行高通量測序分析。

2 結果與分析

2.1 青菜頭泡菜發酵過程中微生物指標測定結果

圖1 青菜頭泡菜發酵過程中乳酸菌數與細菌總數的變化Fig.1 Changes of lactic acid bacteria and total number of bacteria during the fermentation of Brassica juncea pickles

由圖1可知，菌落總數在發酵第0天較高，這是由于涪陵青菜頭泡菜采用陳年泡菜水為母水引子進行發酵而成，而陳年泡菜水中菌落總數和乳酸菌數較多[6]，且青菜頭本身帶有部分細菌。發酵1～5 d，乳酸菌數、菌落總數增加迅速，并在第5天達到峰值8.53，8.71 lg CFU/mL，此時乳酸菌含量達到97.93%，說明乳酸菌已快速生長繁殖成為青菜頭泡菜的優勢菌群。也有研究表明添加泡菜老湯水能促進泡菜中的乳酸菌迅速成為優勢菌群[7]。發酵5～9 d，乳酸菌數、菌落總數逐漸減少并趨于平穩，在發酵后期乳酸菌產生大量乳酸導致乳酸菌生長受到反饋抑制。

2.2 青菜頭泡菜發酵過程中理化指標測定結果

2.2.1 pH值、總酸在青菜頭泡菜發酵過程中的變化

圖2 青菜頭泡菜發酵過程中pH值、總酸的變化Fig.2 Changes of pH values and total acids during the fermentation of Brassica juncea pickles

泡菜發酵過程中產出的代謝產物對其口感(酸度、甜度、脆度、苦味等)和風味均有重要影響，而pH值和總酸含量直接影響著泡菜微生物的生長和代謝產物的生成。由圖2可知，在整個發酵過程中，pH值呈先上升后降低的趨勢，相應的總酸含量呈先下降后上升的趨勢，在發酵前期(0～3 d)，pH值含量明顯升高，總酸含量迅速降低，可能是由于青菜頭泡菜按青菜頭∶泡菜母水∶涼開水為2∶1∶4的比例制作，泡菜母水中有機酸和H+含量較高，導致新制青菜頭泡菜乳酸代謝途徑因泡菜母水乳酸的積累產生反饋抑制作用，使總酸含量呈現一定的下降趨勢[8]，發酵中后期(3～9 d)，青菜頭泡菜的pH值迅速降低，總酸含量迅速上升，此時乳酸菌已大量繁殖成為優勢菌群，產酸，與圖1乳酸菌數的變化一致。

2.2.2 亞硝酸鹽含量在青菜頭泡菜發酵過程中的變化

圖3 青菜頭泡菜發酵過程中亞硝酸鹽含量的變化Fig.3 Changes of nitrite during the fermentation of Brassica juncea pickles

青菜頭泡菜在整個發酵過程中亞硝酸鹽含量整體較低，在0.19～0.27 mg/kg之間。在發酵初期(0～1 d)，亞硝酸鹽含量迅速增加，在發酵第1天達到峰值，由于青菜頭表面攜帶大量微生物通過硝酸還原酶將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽而形成“亞硝峰”。而隨著發酵的進行，在發酵1～9 d，泡菜中乳酸菌數迅速增加，亞硝酸鹽含量迅速降低，有研究表明乳酸菌中含有亞硝酸還原酶能分解亞硝酸鹽[9]，康建依等研究表明乳酸菌數與亞硝酸鹽含量呈此消彼長得趨勢。

2.2.3 樣品細菌稀釋曲線

通過對傳統青菜頭泡菜不同發酵時期(0，1，3，5，7 d)的泡菜鹽水進行細菌16S rDNA基因V3～V4區測序，5個樣品產生1，106，326條高質量序列(重復5次)，統計所有樣品優質序列長度平均約為450 bp。由圖4可知，隨著測序量的增加，細菌稀釋曲線(Sobs指數、Shannon指數)接近平臺期達到飽和，表明測序數據足以代表整個種群。

圖4 樣品的細菌稀釋曲線Fig.4 The bacterial dilution curves of samples

2.2.4 樣品的信息以及微生物多樣性

各樣品Alpha多樣性指數值統計見表1。

表1 樣品的信息以及微生物多樣性Table 1 The samples＇ information and microbial diversity

由表1可知，ACE指數和Chao1指數在發酵第1天時最大，細菌種類數最高，說明陳年泡菜水能快速啟動泡菜發酵系統；Shannon指數的變化與Simpson指數的變化呈負相關，Shannon指數隨著發酵的進行呈先下降再升高的趨勢，在發酵第0天Shannon指數最大，說明物種多樣性在發酵初期第0天最大，隨著發酵的進行，細菌多樣性下降，到發酵后期又有一定上升，這可能是由于第0天加入的新鮮青菜頭上附著大量的細菌，而隨著發酵的進行，泡菜逐漸成熟，乳酸菌迅速繁殖成為優勢菌群，抑制了其他雜菌的成長[10]。

2.2.5 樣品細菌菌群結構分析

圖5 青菜頭泡菜發酵過程中屬水平菌落結構分析Fig.5 Analysis of bacterial colony structure of Brassica juncea pickles at genus levelin the fermentation process

由圖5可知，在屬水平上的細菌屬主要有片球菌屬(Pediococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、腸桿菌屬(Enterobacter)和歐文氏菌屬(Erwinia)，其中，片球菌是其優勢菌屬，李恒等[11]通過對傳統泡菜中微生物群落的動態變化研究發現乳桿菌屬是泡菜母水中的主要細菌屬，于文平等[12]研究表明，消化乳桿菌和植物乳桿菌為青菜泡菜發酵過程中的優勢菌群，汪冬冬等[13]通過對二輪鹽漬工業泡菜微生物群落結構解析研究表明豇豆、蘿卜和榨菜的主要優勢細菌為芽孢桿菌屬，均與本研究結果不同，可能是由于地域、泡菜原料、輔料及加工工藝等存在差異。通過比較發現，在發酵前期(0～1 d)，片球菌屬含量從65.13%迅速增加至83.35%，明串珠菌屬含量從0.67%增加至0.72%；在發酵中后期(3～7 d)，片球菌含量基本不變，明串珠菌含量從0.69%迅速降低至0.03%，由此可推測片球菌與明串珠菌能快速啟動發酵，在發酵初期發揮主要作用，黃存輝等[14]也研究表明明串珠菌能快速啟動發酵。明串珠菌含量在發酵后期迅速降低，是因為其不耐酸，而泡菜水中總酸在后期含量較高。隨著發酵的進行，乳桿菌屬含量從30.49%降到8.86%，假單胞菌屬含量從0.2%降到0.02%，腸桿菌屬含量從1.2%降到0.56%，歐文氏菌屬含量從1.47%降到0.58%，然后升高到0.71%，說明乳桿菌屬在陳年泡菜母水中含量較高，而其含量隨著發酵的進行逐漸降低并趨于穩定，發酵后期泡菜水的酸度增加，抑制了部分微生物的繁殖生長。

2.2.6 樣品細菌群落相似性分析

PCA分析見圖6，在發酵第3天細菌種類分散度最高，然后依次為第1，5，0，7天。其中，發酵第7天優勢菌比例最高并且細菌種類分散度最低，此時總酸含量最高，pH值最低；發酵第3天優勢菌比例最低并且細菌種類分散度最高，而此時總酸含量最低，pH值最高。可能是由于總酸含量較低時，一些非優勢菌能大量生長，從而降低了優勢菌所占的比例，導致細菌種類分散度升高。

圖6 青菜頭泡菜發酵過程中細菌菌落相似性分析Fig.6 The similarity analysis of bacterial colony of Brassica juncea pickles in the fermentation process

2.2.7 樣品聚類分析

圖7 青菜頭泡菜發酵過程中聚類熱圖Fig.7 The cluster heat diagram of Brassica juncea pickles in the fermentation process

由圖7可知，對不同發酵時間的5個樣品在屬分類水平的物種豐度相似性進行聚類分析。通過對顏色梯度及相似程度進行分析，D0與其他樣品差距較大，D1和D3基本接近，D5和D7基本接近，說明隨著泡菜發酵的成熟，樣品之間的微生物差異性減少，物種豐度越來越相似。發酵前期D1中含量較多的假單胞菌(Pseudomonas)、腸桿菌(Enterobacter)和歐文氏菌(Erwinia)均屬于變形菌門，有研究表明，變形菌門能促使泡菜水亞硝酸鹽的生成[15]，與泡菜樣品中亞硝酸鹽含量在第1天達到峰值的結果相對應。在發酵后期，泡菜樣品的微生物多樣性相對減少，主要含有乳桿菌屬(Lactobacillus)和片球菌屬(Pediococcus)均屬于厚壁菌門。

3 結論

以陳年泡菜水為母水引子發酵青菜頭泡菜，在整個發酵過程中乳酸菌與菌落總數逐漸增加，而微生物多樣性與豐度逐漸降低，到發酵末期菌群結構相似性較大。在屬水平上，片球菌為優勢菌群，隨著泡菜發酵時間的推移(0～7 d)，片球菌含量從65.13%增加到88.47%，發酵前期存在假單胞菌(Pseudomonadaceae)、腸桿菌(Enterobacteriaceae)和歐文氏菌(Erwinia)等變形菌門菌群。pH值呈先上升后降低的趨勢，總酸含量呈先下降后上升的趨勢，亞硝酸鹽含量整體較低，在0.19～0.27 mg/kg之間。