基于二次回歸旋轉(zhuǎn)正交法優(yōu)化香菇多糖的提取工藝

張弘弛，劉瑞*，焦樂樂，周鳳，李慧，楊陽

(1.大同大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009；2.大同大學(xué)應(yīng)用生物技術(shù)研究所，山西 大同 037009)

香菇(Lentinusedodes(Berk.) Sing)，又稱香菌，自古以來就有“山珍之王”的稱號，其食用量僅次于世界第一食用菌蘑菇，在營養(yǎng)價(jià)值和食用價(jià)值方面應(yīng)用前景很大[1]。香菇中富含人體必需的氨基酸[2]、各類維生素、礦物質(zhì)和嘌呤等營養(yǎng)成分，特別是香菇多糖成分[3]。香菇多糖具有多種生物學(xué)功能，多糖能夠參與人體抗原抗體的特異性免疫反應(yīng)，使T淋巴細(xì)胞的功能變?yōu)樵瓉淼恼Ｋ剑瑥亩_(dá)到抗腫瘤的功效[4]。香菇多糖對于大多數(shù)病毒具有直接或者間接的抑制作用，能夠刺激人體細(xì)胞釋放特異性抗體，該抗體可以有效抑制多種病毒[5]。香菇多糖還具有清除DPPH自由基能力，并且對羥自由基也有很好的抑制作用[6]。香菇多糖可降低肝糖原含量，具有保肝解毒的作用。此外，香菇多糖還具有降血糖、降血脂等功效[7]。

目前，香菇多糖的提取方法主要有：熱水浸提法，此法容易操作，對設(shè)備的要求較低[8]，對藥品的要求低，具有維持多糖生物學(xué)活性不變的優(yōu)點(diǎn)，并且提取工藝成本較低，非常適合大規(guī)模生產(chǎn)，因而被絕大多數(shù)工業(yè)生產(chǎn)所采用。微波法提取，該方法能夠彌補(bǔ)熱水提取耗時(shí)的缺點(diǎn)[9]，微波能穿過細(xì)胞膜, 直接作用于植物的細(xì)胞[10]，當(dāng)使用微波處理時(shí)，溫度急劇上升使細(xì)胞擴(kuò)大膨脹，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞的內(nèi)容物分散出來[11]。超聲輔助提取法，此法利用超聲波頻率控制引起的空化作用，使得植物細(xì)胞破碎，細(xì)胞膜被破壞[12]，但是對多糖的結(jié)構(gòu)無影響，多糖能夠迅速地溶解在溶劑中[13]。該法在提高多糖提取率、減少提取時(shí)間、便于操作等方面表現(xiàn)得尤為突出[14]。

相對于一般的正交試驗(yàn)方法，二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)具有模型覆蓋率全面、分析結(jié)果更接近實(shí)際值、回歸方程相關(guān)性好等優(yōu)點(diǎn)[15]。因而，本研究試驗(yàn)設(shè)計(jì)依據(jù)單因素結(jié)果，采用二次回歸旋轉(zhuǎn)正交法對香菇多糖的提取率進(jìn)行分析，研究影響香菇多糖提取過程中因素之間的協(xié)同和交互作用，從而獲得最優(yōu)的香菇多糖提取條件，為精密的香菇多糖工業(yè)提取工藝提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)[16]。

1 材料與方法

1.1 材料

干香菇：購于上海蠣赫生物科技有限公司；葡萄糖：天津市化學(xué)試劑供銷公司；苯酚、無水乙醇、濃硫酸：天津化工研究所：水：蒸餾水，自制。

1.2 儀器

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市國旺實(shí)驗(yàn)儀器廠；UV-3200S紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；Scientz-1000C 超聲波萃取儀 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 苯酚-濃硫酸法測定多糖含量

1.3.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確稱取10 mg的葡萄糖對照品粉末于燒杯中攪拌溶解，倒入100 mL容量瓶中定容至刻度，即制成0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液[17]。按表1配制不同濃度梯度的溶液，搖勻，置于50 ℃溫水中反應(yīng)10 min，降溫終止反應(yīng)。采用紫外可見分光光度計(jì)在490 nm波長下測定吸光度值，重復(fù)3次取平均值。其中，1號試管中的溶液為空白對照。

表1 溶液配制表Table 1 The preparation of solution

1.3.1.2 香菇多糖提取率的計(jì)算

取1支潔凈的試管，用移液槍準(zhǔn)確量取1 mL制備的香菇多糖提取溶液放置其中，按照上述方法測定吸光度A。香菇多糖提取率及得率的計(jì)算公式：提取率=(香菇多糖的濃度×定容后的體積×稀釋倍數(shù))/香菇粉末的質(zhì)量×100%。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 浸提時(shí)間對香菇多糖提取的影響

稱取6份3 g香菇粉末分別置于錐形瓶中并編號。按照1∶40(g/mL)的料液比加蒸餾水，將溶液在50 ℃恒溫水中浸提0.5，1，1.5，2，2.5，3 h后，設(shè)定超聲功率1000 W，45 ℃下超聲輔助提取30 min。超聲后，將試液轉(zhuǎn)入離心管以8000 r/min離心3 min。棄沉淀對上清液進(jìn)行抽濾，將濾液轉(zhuǎn)移至錐形瓶中待用。按上述方法測定香菇多糖提取率。試驗(yàn)結(jié)果分析和繪圖采用Origin 2017，下同。

1.3.2.2 料液比對香菇多糖提取的影響

稱取6份2 g香菇粉末于錐形瓶中并編號。按照1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60(g/mL)的料液比加蒸餾水混勻，設(shè)定超聲功率1000 W，45 ℃下超聲輔助提取30 min。相同步驟測定香菇多糖提取率。

1.3.2.3 超聲時(shí)間對香菇多糖提取的影響

稱取6份3 g香菇粉末于錐形瓶中并編號。按照1∶40(g/mL)的料液比加蒸餾水混勻，設(shè)定超聲功率1000 W，45 ℃下超聲輔助提取，超聲提取時(shí)間設(shè)定為0，10，20，30，40，50 min。相同步驟測定香菇多糖提取率。

稱取6份3 g香菇粉末于錐形瓶中并編號。按照1∶40(g/mL)的料液比加蒸餾水混勻，設(shè)定超聲功率1000 W，超聲輔助提取30 min。超聲溫度分別為20，30，40，50，60，70 ℃。相同步驟測定香菇多糖提取率。

1.3.2.5 超聲功率對香菇多糖提取的影響

稱取6份3 g香菇粉末于錐形瓶中并編號。按照1∶40(g/mL)的料液比加蒸餾水混勻，熱水浸提1 h，45 ℃下超聲輔助提取30 min。超聲功率分別為400，600，800，1000，1200，1400 W。相同步驟測定香菇多糖提取率。

1.3.3 二次回歸旋轉(zhuǎn)正交組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，篩選確定出4個(gè)單因素的5個(gè)較佳水平。該試驗(yàn)以這4個(gè)因素為自變量，設(shè)計(jì)得到表2的因素編碼表。試驗(yàn)結(jié)果分析和繪圖采用DPS 7.05。

表2 正交試驗(yàn)因素水平編碼表Table 2 The factors and levels of orthogonal test

1.3.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)

如圖3所示，在功能劃分上，DSP28335僅用于回波信號經(jīng)功率放大、濾波、A/D轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)處理，由于運(yùn)算量較大，盡可能地節(jié)約DSP28335的片內(nèi)資源，障礙物的距離信息最終在DSP28335中運(yùn)算獲得，之后通過操作地址總線與數(shù)據(jù)總線存儲于雙口RAM中。STM32F103相對于DSP28335運(yùn)算能力較差，因此在該系統(tǒng)中分配為LCD顯示、串口通信、參數(shù)儲存、信號發(fā)射等對運(yùn)算速度要求相對較低的功能。目標(biāo)的距離信息在DSP28335存儲到雙口RAM后，STM32F103可以實(shí)時(shí)獲取該輸入值，雙口RAM可供DSP28335與STM32F103同時(shí)讀寫，方便快捷。

按照二次回歸旋轉(zhuǎn)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的優(yōu)化方案進(jìn)行驗(yàn)證，得出的試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測值進(jìn)行比較，判斷回歸模型結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

試驗(yàn)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=3.1858x+0.0127，R2=0.9989，因此該方程具有良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 浸提時(shí)間對香菇多糖提取的影響

圖1 浸提時(shí)間對香菇多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on the extraction rate of polysaccharides from Lentinus edodes

由圖1可知，當(dāng)熱水浸提時(shí)間由0.5 h按梯度升高到3 h時(shí)，香菇多糖得率呈現(xiàn)出先升高再降低的倒U形曲線。當(dāng)浸提時(shí)間為1.5 h時(shí)達(dá)到最高值，時(shí)間繼續(xù)延長時(shí)，多糖得率反而呈現(xiàn)下降的趨勢。這是因?yàn)榻釙r(shí)間過長時(shí)，胞內(nèi)水解酶游離至提取液中，部分多糖被水解。因此綜合考慮取0.5～2.5 h作為浸提時(shí)間的5個(gè)水平。

2.2.2 料液比對香菇多糖提取的影響

圖2 料液比對香菇多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ratio of solid to liquid on the extraction rate of polysaccharides from Lentinus edodes

由圖2可知，當(dāng)料液比由1∶10 按梯度升高到1∶60，香菇多糖得率呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢。料液比為1∶30時(shí)提取率最高。這是因?yàn)榱弦罕缺稊?shù)低時(shí)，溶質(zhì)和溶液的接觸面積小，提取不充分，導(dǎo)致得率偏低；隨著倍數(shù)增加，溶液的密度隨之降低，能夠充分提取。綜合考慮，料液比的5個(gè)水平為1∶20～1∶60。

2.2.3 超聲時(shí)間對香菇多糖提取的影響

圖3 超聲時(shí)間對香菇多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of polysaccharides from Lentinus edodes

由圖3可知，當(dāng)超聲時(shí)間升高到60 min時(shí)，香菇多糖得率呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢。超聲時(shí)間為40 min時(shí)多糖得率達(dá)到最高值，超聲50 min后，多糖提取率明顯下降。故取10～50 min作為超聲提取時(shí)間的5個(gè)水平。

2.2.4 超聲溫度對香菇多糖提取的影響

由圖4可知，當(dāng)超聲溫度由20 ℃按梯度升高到70 ℃，香菇多糖得率呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢。當(dāng)超聲溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，提取率達(dá)到最大值。這是因?yàn)槎嗵窃诟邷叵聲纸獬尚》肿游镔|(zhì)，因此溫度過高提取率降低。但是溫度為70 ℃的提取率要高于20 ℃，說明超聲輔助熱水浸提比常溫水提效果顯著。故取水溫為30～70 ℃作為超聲溫度的5個(gè)水平。

圖4 超聲溫度對香菇多糖提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of polysaccharides from Lentinus edodes

2.2.5 超聲功率對香菇多糖提取的影響

圖5 超聲功率對香菇多糖提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of polysaccharides from Lentinus edodes

由圖5可知，在設(shè)置的超聲功率范圍(400～1400 W)，香菇多糖提取率波動(dòng)范圍不大(從10.3%上升至11.35%)，在超聲功率800～1400 W幾乎恒定(提取率在11.2%～11.4%之間)，提取率達(dá)到最大值，說明在此范圍內(nèi)細(xì)胞的超聲破碎效果已達(dá)到峰值。因而從節(jié)約能量的角度考慮，超聲功率確定為800 W，后續(xù)二次回歸旋轉(zhuǎn)正交試驗(yàn)不再考慮超聲功率的影響。

2.3 優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 二次回歸旋轉(zhuǎn)正交組合的試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。采用DPS 7.05軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，總共有36組試驗(yàn)，其中有12組是為了消除試驗(yàn)的系統(tǒng)誤差及人為誤差法的零點(diǎn)誤差重復(fù)試驗(yàn)。得到的香菇多糖提取率(Y)與4個(gè)因素的二次回歸模型為：

Y=13.65000-0.45833X1+0.87000X2+0.44167X3+0.37500X4-0.17417X12-0.94167X22-0.23667X32-0.31167X42-0.16250X1X2+0.10000X1X3-0.45000X1X4-0.17500X2X3+0.27500X2X4-0.38750X3X4。

表3 二次回歸旋轉(zhuǎn)正交組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 The design and results of quadratic regression rotation orthogonal combination test

在α=0.01的顯著水平下，軟件智能除去不顯著的X12、X1X2、X1X3、X2X3、X2X4，得到優(yōu)化后的回歸方程為：

Y=13.65000-0.45833X1+0.87000X2+0.44167X3+0.37500X4-0.94167X22-0.23667X32-0.31167X42-0.45000X1X4-0.38750X3X4。

香菇多糖提取率與浸提時(shí)間、料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度這4個(gè)因素的相關(guān)系數(shù)(R2)=回歸平方和/總平方和=73.4359/85.8764=0.8551，從該系數(shù)可以得知香菇多糖的提取率由這4個(gè)因素所影響的百分比為85.51%，其他各種因素及其誤差所影響的百分比為14.49%。

上述二次回歸方程中的X1(浸提時(shí)間)、X2(料液比)、X3(超聲提取時(shí)間)、X4(超聲提取溫度)，試驗(yàn)結(jié)果的方差分析及可信度分析見表4。

表4 方差分析表Table 4 The variance analysis results

由表4可知，回歸方程的失擬檢驗(yàn)F1值為1.73324<2.948[18]及F0.01(10，11)=2.25，P=0.1385>0.05，說明失擬性差異在本試驗(yàn)中不是很顯著，因此使用正交模型是很恰當(dāng)?shù)摹；貧w方程的顯著性檢驗(yàn)F2=8.85445>3.03及F0.05(14，21)=3.49，P=0.0001<0.001，此數(shù)據(jù)說明回歸是極顯著的。由此可以說明，本模型對香菇中多糖的提取含量有著較準(zhǔn)確的預(yù)測。其中，因素X1、X2和X22對香菇多糖的提取有極顯著影響(P<0.01)。F值越大，該單因素對香菇多糖提取率的影響越大，對提取工藝的優(yōu)化也就越重要[19]。由表4可知FX1=8.5105，F(xiàn)X2=30.6642，F(xiàn)X3=7.9028，F(xiàn)X4=5.6971。根據(jù)F值可對各因素影響香菇多糖提取的效果進(jìn)行排序：料液比X2>浸提時(shí)間X1>超聲溫度X3>超聲時(shí)間X4。

2.3.2 單因素效應(yīng)分析

運(yùn)用控制變量法，將其中的一個(gè)因素固定在零水平，分別對其余的3個(gè)因素進(jìn)行考察并作圖，分析這些因素對香菇多糖提取率的影響效果。

圖6 單因素效應(yīng)分析圖Fig.6 Effect of each factor on extraction rate

由圖6可知，超聲時(shí)間和超聲溫度這兩個(gè)因素呈現(xiàn)出正相關(guān)性，隨著因素水平的增加，多糖的提取率也在逐漸增加；但是增加浸提時(shí)間，多糖的提取率基本不變且略微下降，說明浸提時(shí)間對提取率的影響不顯著；料液比在一定的范圍內(nèi)增加時(shí)，提取率也相應(yīng)地增加，如果超出這個(gè)范圍，提取率就開始有下降趨勢。

2.3.3 浸提時(shí)間與超聲溫度的交互作用分析

圖7 浸提時(shí)間與超聲溫度的交互圖Fig.7 Effect of interaction between extraction time and ultrasonic temperature

從優(yōu)化后的回歸方程中可以得出，浸提時(shí)間(X1)和超聲溫度(X4)、超聲時(shí)間(X3)和超聲溫度(X4)都存在互作效應(yīng)，對香菇多糖的提取率有顯著影響，均存在協(xié)同效應(yīng)。其他兩兩因素之間也均存在互作，但顯著性不是特別明顯。由圖7可知，當(dāng)超聲時(shí)間和料液比恒定在零水平時(shí)，反映出X1與X4兩因素之間有很強(qiáng)的交互作用。當(dāng)X1為0.5 h、X4為60 ℃時(shí)，達(dá)到最高的提取率。這是因?yàn)槌晻r(shí)間比較長時(shí)，對于料液比的要求也會相應(yīng)地增加，延長空化作用時(shí)間能夠促進(jìn)料液比低的樣品內(nèi)多糖都溶解在水中。由此可知，該提取工藝應(yīng)當(dāng)相應(yīng)地選擇較高且適宜的超聲溫度并且選擇合適的浸提時(shí)間，從而既能節(jié)省時(shí)間，又可提高提取率。

2.3.4 超聲時(shí)間與超聲溫度的交互作用分析

圖8 超聲時(shí)間與超聲溫度Fig.8 Effect of interaction between ultrasonic time and ultrasonic temperature

由圖8可知，當(dāng)料液比和浸提時(shí)間為零水平時(shí)，X3和X4的交互作用對多糖提取率的影響極明顯。根據(jù)交互圖中的截面曲線進(jìn)行分析，可知當(dāng)超聲時(shí)間為20 min、超聲溫度為60 ℃時(shí)，交互曲面達(dá)到最高點(diǎn)，多糖提取率達(dá)到最大值。隨著X3和X4的水平升高，香菇多糖的提取率先上升后下降。這是因?yàn)闀r(shí)間和溫度對提取率的影響都很顯著，并且二者是同一個(gè)儀器同時(shí)進(jìn)行，所以相互作用也就更強(qiáng)一些。由此可知，在香菇多糖的優(yōu)化提取工藝時(shí)，必須注意超聲時(shí)間和超聲溫度的變化范圍。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

模型預(yù)計(jì)香菇多糖的提取率為15.97%，試驗(yàn)測得實(shí)際的平均多糖提取率為15.86%。為了避免誤差，此驗(yàn)證試驗(yàn)重復(fù)3次，軟件預(yù)測值與實(shí)際測得值相差不大，說明該模型可靠性高。同時(shí)相對于各個(gè)單因素試驗(yàn)，在優(yōu)化后的工藝條件下，香菇多糖的提取率明顯提升。

3 結(jié)論與討論

通過對多個(gè)單因素進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，本研究選擇其中影響最顯著的4個(gè)單因素，獲得了5個(gè)水平，按照因素水平編碼表應(yīng)用二次回歸旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計(jì)組合法對香菇多糖的提取方案進(jìn)行優(yōu)化。從而獲得最佳提取操作條件：浸提時(shí)間為0.5 h，料液比為1∶40，超聲時(shí)間為20 min，超聲溫度為60 ℃。經(jīng)過多次驗(yàn)證試驗(yàn)，證明該提取工藝穩(wěn)定可靠。

在本試驗(yàn)中，提取的生物大分子為香菇中的多糖，雖然香菇中的多糖有著各種各樣的生物學(xué)活性，但是香菇多糖極其不穩(wěn)定，溫度過高會導(dǎo)致多糖的分解或者結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而生物學(xué)活性降低，所采用的材料是購買的干香菇，試驗(yàn)材料的干燥方式不明確，可能造成香菇多糖損失，使其提取率比實(shí)際含量低。香菇多糖的單糖單元也各有不同，主要有兩種形式，分別為同多糖和雜多糖。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制是以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，同多糖又為葡聚糖，它的單糖單元為葡萄糖；但是雜多糖的單糖單元有較大差異，使用該標(biāo)準(zhǔn)曲線并不能夠?qū)⑺械亩嗵菣z測計(jì)算。后續(xù)研究中，在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們會進(jìn)一步精細(xì)化研究方案，進(jìn)行更加精確的試驗(yàn)。