N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍灌胃配合復合因素建立大鼠胃癌模型*

李璐璐，陳國忠，吳瑕，袁鐵超，王婕，歐智海，易志忠

1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530000； 2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530000

在腫瘤的發生中，胃癌因其極高的發生率和致死率，以及逐漸趨向年輕化，嚴重威脅人類的健康。2018年，我國胃癌的發病人數已占全球總發病人數的45%。及時干預并阻斷胃癌前病變的進展能降低胃癌發生率，達到二級預防效果。因此，研究胃癌前病變進展過程，探討胃癌的發病機制，建立一個穩定可靠的動物胃癌模型成為治療的首要前提。本實驗選擇目前常用的N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(N-Methyl-N′-Nitro-N-Nitrosoguanidine，MNNG)給藥方式和濃度并進行改良[1-4]，探討一種新的簡單易行、實用性強的造模方式。

1 材料

1.1 動物SPF級雄性Wistar大鼠50只，4周齡，體質量(50±2) g，購于廣西醫科大學實驗動物中心，在廣西中醫藥大學實驗中心飼養，每籠3～4只，室溫25 ℃，每天光照10 h，非造模時常規飲食和飲用水飼養。動物使用許可證號：SCXK(桂)2009-2003。實驗涉及動物的飼養和實驗過程中嚴格遵守廣西中醫藥大學實驗動物管理與保護的有關準則。

1.2 試劑MNNG(東京化成工業株式會社，批號：8WF3N-JQ)；含2%氯化鈉的高鹽飼料(南京盛民科研動物養殖場，批號：3105231)；40 ng·L-1多聚甲醛通用型組織固定液(北京蘭杰柯科技有限公司，貨號：70081800)；蘇木素染色液(上海碧云天生物技術有限公司，貨號：C0107)；鹽酸乙醇快速分化液(上海碧云天生物技術有限公司，貨號：C0163M)；伊紅染液(上海碧云天生物技術有限公司，貨號：C0109)；中性樹膠(北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號：ZLI-9555)；水合氯醛(成都市科隆化學品有限公司，貨號：302-17-0)；二甲苯(天津市永大化學試劑有限公司)；無水乙醇(天津市永大化學試劑有限公司，批號：20160908)；體積分數95%乙醇(天津市永大化學試劑有限公司，批號：20160806)。

1.3 儀器KD-T型生物組織攤烤片機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)；BX43型光學顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 建立動物模型將50只大鼠隨機分為對照組和實驗組，每組25只。對照組予生理鹽水灌胃，實驗組以100 g·L-1MNNG為起始濃度，之后每10周增加25%，直到濃度為150 g·L-1的方式灌胃，連續灌胃40周。對照組正常飼料和頻率喂食，實驗組均以高鹽飼料喂食并配合饑飽失常(饑1天，飽1天)，同時予常規飲用水飲用。

2.2 大鼠體質量變化在第20周時分別從各實驗組與對照組中隨機抽取10只大鼠稱體質量。

2.3 收集大鼠胃組織實驗組每日灌胃1次，從第16周時開始，每隔4周分別從不同組隨機抽取3只大鼠處死(實驗過程中自行死亡的大鼠也需及時進行尸檢)，至第40周全部處死。暴露并游離胃，將胃切開，首先在腫瘤組織中取標本，若無肉眼腫物則分別在胃底、胃體、胃小彎、幽門及十二指腸取材，40 ng·L-1多聚甲醛固定，送病理科進行病理組織鑒定，記錄并對比各組胃癌組織的發生時間、浸潤侵襲情況及突破黏膜層的程度。

3 結果

3.1 大鼠的一般狀態對照組大鼠飲食正常，體質量增加，反應靈敏，皮毛光澤。實驗組大鼠進食減少，體質量減輕，反應遲鈍，皮毛晦暗，嗜睡，蜷縮，無精神。與對照組比較，實驗組大鼠在第20周時體質量極顯著降低(P<0.01)，見表1。

表1 第20周時大鼠體質量比較

3.2 病理結果當胃組織中有不同程度的異型增生、或腸化，或提示胃癌，表示造模成功。實驗組第24周造模成功，病理提示腸化生伴輕度不典型增生；第26周大鼠自行死亡1例，病理提示輕度異型增生伴腸化生。第30周自行死亡1例，病理結果提示胃癌，其中各組自行死亡大鼠或因死亡時間過長未送病檢，或病理結果未提示造模成功的，不納入總計數量。實驗組成模情況為胃組織出現重度不典型增生3只、輕度不典型增生3只、腸化生7只、胃癌4只，無效4只，成功率80.95%。實驗組不同周數的病理演變見圖1～圖5。

注：A：(HE染色，×100)；B：(HE染色，×200)；C：(HE染色，×400)圖1 正常組大鼠胃組織16～20周形態學變化

圖2 實驗組胃組織24～26周(腸化生)病理損傷變化(HE染色，×200)

圖3 實驗組胃組織28～30周(輕度不典型增生)病理損傷變化(HE染色，×400)

圖4 實驗組胃組織28～30周(重度不典型增生)病理損傷變化(HE染色，×200)

圖5 實驗組胃組織30～40周(胃癌)病理損傷變化(HE染色，×200)

3.3 兩組大鼠存活情況統計對照組存活22只，存活率88.0%；自行死亡3只，死亡率12%。實驗組存活19只，存活率76.0%；自行死亡6只，死亡率24%。見表2。

表2 兩組大鼠存活情況統計

4 討論

研究認為，胃癌典型發展順序是：慢性炎癥-萎縮性胃炎-萎縮性胃炎伴腸化生-異型增生-胃癌[5-6]，這一過程與多因素作用相關。造模時需參考這些因素并應用。目前大鼠胃癌造模尚無公認的造模方法，盡管MNNG試劑已被廣泛應用，但給藥方式、時間和濃度的差異會導致誘發率低且周期較長，實驗模式復雜，操作繁瑣，實驗成本較高，難以達到預期的效果。而MNNG單因素誘發胃癌造模成功率較低，因此常配合高鹽食物、酒精[7-8]、幽門螺桿菌[9]等多種復合因素的干預以提高效率。設計實驗時，實驗組模擬胃癌形成的過程，僅將高鹽飼料及饑飽失常作為危險因素在大鼠胃癌造模中聯合應用，簡化實驗。

研究認為，高鹽可以破壞胃黏膜屏障[10-11]，使得胃黏膜處于損傷-修復-再損傷的循環，炎癥細胞浸潤，對腫瘤細胞的生長和轉移均有促進作用，誘導胃組織的異型增生。長期飲食不規律也是誘發胃癌的高危因素[12]，會造成胃蠕動及排空的失衡，增加MNNG及高鹽飼料與胃黏膜接觸時間，進一步損傷保護屏障。已知MNNG使用方式有自由飲用和灌胃兩種模式，在前期實驗發現，MNNG藥物采用自由飲用方式干預，受大鼠的個體差異(如食欲、情緒、環境等)影響較大，實際攝入量無法把控，難以達到理想濃度，使得造模拖延。因此，實驗組采用灌胃模式，盡可能保證藥物攝入。結合目前已報道的文獻[13-16]，MNNG給藥濃度和時間無明確定論，多數實驗將MNNG濃度設在100～200 ng·L-1，飲用MNNG 20～40周可成功造模，灌胃MNNG在10～30周可成功造模，但造模成功率無法保證，且造模成功節點無明確闡釋，對大鼠死亡率并無確切描述。在設計本次實驗時，實驗組采用以100 ng·L-1為起始濃度，之后每10周增加25%的梯度濃度造模，采用循序漸進的方法。

研究顯示[17]，低濃度MNNG灌胃造模時間較長，成功率低，其原因不排除隨著大鼠周數的增長，大鼠出現耐藥情況，低濃度不再敏感，且低濃度MNNG灌胃后大鼠胃組織病理變化以腸化生為主，無法得到理想的胃癌病變模型。高濃度MNNG持續灌胃可建立大鼠胃癌模型，但對大鼠刺激較大，死亡率非常高，胃組織容易出現黏膜發生突變，進展過程隱匿且迅速，胃癌的發病模式無法體現上述人類典型模式[18]。當胃黏膜病變進展過快，對實驗標本采集時間的掌握和靈活度要求更高，實驗難度系數增大。因此本研究目的是探討如何簡化實驗，運用梯度灌胃MNNG，是否既能保證攝入濃度，盡可能減少大鼠死亡率，又能獲得良好連續的造模效果，這也是本課題的意義所在。

本研究實驗組成功率可達到80.95%，成功率較高，整個過程完整、連續，第16周可見大鼠胃黏膜有大量淋巴細胞及中性粒細胞浸潤，20周胃底腺可見萎縮并減少，黏膜變薄，24周可見輕度不典型增生伴腸腺化生，28周可見胃腺體重度不典型增生，30周可見早癌組織，黏膜層連續完整，第32周可見浸潤到肌層，第36周胃癌突破到漿膜層，清晰呈現從胃炎發展到胃癌的不同階段。實驗組存活率為76%，與對照組相比，差異無統計學意義。與其他同類型實驗比較，存活率更高[19]。實驗過程中出現大鼠死亡的因素大多為灌胃操作導致的機械性損傷。本研究發現，實驗組與對照組存活率無明顯差異，提示實驗組遞進MNNG濃度灌胃并不會造成大鼠死亡率的增加，優于其他類型MNNG誘導胃癌模型[3-4]。本研究實驗組前期采用低劑量MNNG大鼠逐漸適應，后期隨著大鼠周齡增大并遞增給藥劑量，在一定程度上可改善大鼠耐藥情況，讓大鼠在耐受的情況下保證盡可能多的攝入MNNG，也能減輕因劑量突然變化對其的刺激影響，減少大鼠死亡率。本研究發現，大鼠的死亡主要發生在后期，此時大鼠進食減少，體質量迅速下降，解剖時發現食管和胃黏膜潮紅、大量散在糜爛病灶和活動性潰瘍，腸脹氣明顯，考慮除了灌胃引起的機械性損傷外，可能與高濃度MNNG毒性增大引起的急性黏膜損傷相關。

胃癌前病變是胃癌發生的重要節點，這一階段的早期診斷和干預是胃癌防控的關鍵，截斷甚至逆轉胃癌前病變的發展成了目前研究的熱點，而建立一個高效可行的胃癌前病變模型，尤為關鍵。實驗組造模過程穩定完整，可為研究癌前病變各個階段特征、探討藥物干預的時機及指導抗腫瘤治療提供優良的模型。造模方式簡單易行，對實驗設備及操作要求較低，與人類的病理發病情況相符，保證造模的真實性和實用性，便于推廣。結合本實驗數據提示36周是理想的造模周期，若要獲取胃癌前病變的模型，可靈活提前至24周；若要造模時間更短，可調整遞增濃度的時間區間，不建議再提高遞增的濃度。

使用MNNG誘導胃癌的造模方式，并不斷尋找MNNG最佳濃度以獲得最好的效果。研究發現，不同月齡大鼠其臟器系數、組織學異常及疾病的發生與年齡呈現出相關性，因此課題組認為，隨著大鼠周數的改變設置時間和濃度區間，更能保證造模的質和量，減少藥物的浪費與污染[20]。但如何根據不同月齡大鼠生理病理差異設計出更精準的區間，仍然需要大量的后期摸索，各實驗室應該根據自身條件不斷設計并積累研究數據，總結經驗，以供參考。

采用MNNG梯度濃度結合復合因素的方法，可成功建立理想的大鼠胃癌模型，此法誘發率高、周期短、實驗簡單、費用低，在大鼠胃癌造模方式中，尤其是在觀察胃癌前病變的發生和發展方面，更具優勢。