馬鞭草苷通過NF-κB/MAPK信號通路干預支氣管哮喘大鼠氣道炎癥、氣道平滑肌細胞增殖及RhoA表達的研究*

董淑敏，高鵬輝，梁文華

（1.山東中醫藥大學第一臨床醫學院，山東 濟南 266000；2.青島海慈醫療集團，山東 青島 266000）

支氣管哮喘是一種常見的慢性炎癥性呼吸系統疾病，不可逆性氣流受阻、氣道高反應性、氣道慢性炎癥是該病的主要特征[1]。現代醫學認為支氣管哮喘的發生與炎癥細胞浸潤密切關聯，NF-κB/MAPK信號通路介導炎癥反應，在氣道及肺組織損傷中起到重要作用[2]，控制機體的炎癥反應成為治療支氣管哮喘的重要途徑。西醫在控制感染與炎癥治療方面具有較好的療效，臨床上通常采用糖皮質激素緩解患者氣道炎癥癥狀，并抑制氣道平滑肌細胞增殖，從而起到治療疾病的效果[3]。但西藥治療通常僅局限于對癥治療，且長期藥物治療可導致患者出現各種不良反應。當前，中醫“清熱化痰”法被廣泛應用于氣道炎癥疾病的臨床治療之中，且取得了較好的成效，但其具體作用機制尚不明確。馬鞭草苷是馬鞭草的主要活性成分，具有鎮咳、抗炎之效。本研究通過觀察馬鞭草苷對支氣管哮喘大鼠氣道炎癥、氣道平滑肌細胞增殖、RhoA表達的影響，旨在探究其治療哮喘的實際作用機制，為臨床治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8周齡健康雄性SPF級SD大鼠72只，體質量240~260 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，動物使用許可證號：SYXK（川）2014-189。在室溫25~27℃、相對濕度50%環境中適應性飼養1周。本次研究經醫學實驗動物管理委員會批準同意進行。

1.2 藥物與試劑 卵清白蛋白（美國Sigma，批號：20180910）；氫氧化鋁（淄博化學試劑公司，批號：20181106）；NF-κBp65試劑盒（貨號：SBJ_M0313）、p-NF-κBp65試劑盒（貨號：SBJ_M0314）、p-IκBα試劑盒（貨號：SBJ-R0176）、ERK1/2試劑盒（貨號：SBJ-M0326）、JNK試劑盒（貨號：SBJ-R0160）、p38MAPK試劑盒（貨號：SBJ-R0189）、p-ERK1/2試劑盒（貨號：SBJ-M0327）、p-JNK試劑盒（貨號：SBJ-R0161）、p-p38MAPK試劑盒（貨號：SBJ-R0190）（南京森貝伽生物科技有限公司）；馬鞭草苷（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：20181122）；臨床上馬鞭草苷常用日用劑量為3 mg/kg，按照以下公式換算，drat=dhuman×0.71/0.11，大鼠日用劑量為19.36 mg/kg，考慮到大鼠藥物耐受量比人類更高，故馬鞭草苷高、中、低劑量組劑量分別為80、40、20 mg/kg。

1.3 主要儀器HT2型酶聯免疫檢測儀（奧地利Anthos公司）；MK3型多功能酶標儀（芬蘭Therm公司）；EPS-600型電泳儀（上海天能科技有限公司）；Trans-Blot SD型Western blotting轉膜儀（BioRad公司）。

1.4 造模與分組將72只健康SD雄性大鼠隨機分為對照組、模型組、地塞米松組和馬鞭草苷高、中、低劑量組，每組12只。采用卵清白蛋白致敏法制備支氣管哮喘大鼠模型。各組大鼠（除對照組）在第1天腹腔注射1 mL抗原液（10 mg卵清白蛋白+100 mg氫氧化鋁凝膠+5×109菌株百日咳桿菌疫苗）致敏，并在第8天重復上述步驟加強致敏。第15天開始，每天將大鼠放入密閉玻璃罩內，采用1%卵清白蛋白生理鹽水霧化激發30 min。大鼠出現張口呼吸、點頭呼吸、腹式呼吸、焦躁不安、皮膚瘙癢、動作遲鈍等癥狀說明造模成功[4]。

1.5 實驗給藥剔除造模失敗大鼠，各組均保留10只建模成功大鼠進行后續實驗研究。每次霧化吸入前對大鼠進行藥物灌胃治療，馬鞭草苷高、中、低劑量組劑量分別為80、40、20 mg/kg，地塞米松組劑量為1.5 mg/kg，對照組與模型組給予等體積生理鹽水灌胃，連續治療1周。

1.6 取材末次霧化吸入24 h后，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉大鼠。開胸使雙肺與氣管充分暴露，分離肺組織，并結扎右主支氣管。針頭于氣管插入，注入4 mL生理鹽水灌洗并立即回抽，灌洗3次后收集支氣管灌洗液。4℃2 000 r/min離心5 min后，取上清液保存于-20℃冰箱內備用。剪取右下肺組織采用4%多聚甲醛緩沖液固定，石蠟包埋切片后用蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察大鼠肺組織病理學變化情況。剪取大鼠右上肺保存于-80℃液氮中備用[5]。

1.7 觀察指標

1.7.1 大鼠支氣管灌洗液中炎癥細胞計數取支氣管灌洗液離心后的沉淀，加入10%小牛血清-PBS緩沖液100μL重懸，取0.1 mL滴加到細胞計數板內，2 min后進行白細胞計數。取0.01 mL重懸液進行涂片，瑞氏染色后測定巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞百分比。

1.7.2大鼠氣道平滑肌細胞（ASMCs）增殖情況檢測參考JOHNSON等[6]的方法培養大鼠ASMCs，無血清DMEM培養2~5代細胞，使其同步于G0期。之后采用含10%FBS的DMEM培養24 h。采用PBS緩沖液將收集的ASMCs配制為1×106個/mL的細胞懸液并用乙醇固定，加入碘化丙啶、RNA酶后，采用流式細胞儀檢測細胞增殖情況，并通過配套軟件檢測各期細胞占比情況[7]。ASMCs培養結束時，在96孔板內加入20μL MTT（5mg/mL），4 h后去培養液加入150μL二甲基亞砜，振蕩30 min，檢測各孔450 nm處的吸光度（A值）。

1.7.3 大鼠肺組織RhoA表達水平檢測通過SYBR GreenⅠ熒光染料嵌合法制備RhoA、GAPDH標準曲線，通過標準曲線進行定量。通過TRIzol法提取RNA，逆轉錄后進行PCR擴增。RhoA上 游5＇AACTGGTGATTGTTGGTG3＇，下 游5＇CTGCCACATAGTTTTCAA3＇，114 bp。GAPDH上游5＇GCACCGTCAAGGCTGAGAAC3＇，下游5＇ATGGTGGTGAAGACGCCAGT3＇，142 bp。反應條件：變性95℃30 s，退火95℃5 s，延伸60℃34 s，循環40次。由熒光定量PCR儀分析計算結果，通過2-△△Ct法得相對表達比率。采用Western blotting法檢測大鼠肺組織RhoA表達水平，取出備用標本，剪碎后消化處理，裂解離心提取蛋白質。采用緩沖液稀釋后取50μL樣本加入上樣孔，電泳后轉印至硝酸纖維素膜。TBS封閉過夜，次日TBS洗膜，加入1∶400一抗室溫孵育2 h，加入（1∶2 000）二抗室溫孵育2 h，清洗后采用凝膠成像分析軟件分析檢測電泳條帶的灰度值[8]。

1.7.4 大鼠NF-κB、MAPK信號通路活性檢測 取出大鼠右肺組織，加入4℃生理鹽水研磨成組織勻漿。2 500 r/min離心10 min，取上清液。通過ELISA法檢測各組大鼠NF-κB信號通路NF-κBp65、p-NF-κBp65、p-IκBα與MAPK信號通路ERK1/2、JNK、p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK、p-p38MAPK表達水平，評估馬鞭草苷對支氣管哮喘大鼠NF-κB/MAPK信號通路活性的影響。

1.8 統計學方法 采用SPSS 25.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料采用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠支氣管灌洗液中炎癥細胞計數結果比較 模型組大鼠支氣管灌洗液中巨噬細胞百分比明顯低于對照組（P<0.05），淋巴細胞、中性粒細胞百分比和白細胞計數明顯高于對照組（P<0.01）；地塞米松組和馬鞭草苷高、中、低劑量組大鼠支氣管灌洗液中淋巴細胞、中性粒細胞百分比和白細胞計數明顯低于模型組（P<0.05或P<0.01），巨噬細胞百分比明顯高于模型組（P<0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠支氣管灌洗液中炎癥細胞計數結果比較（±s）

表1 各組大鼠支氣管灌洗液中炎癥細胞計數結果比較（±s）

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，dP<0.01

組別 動物數（只）給藥劑量（mg/kg） 巨噬細胞（%） 淋巴細胞（%）中性粒細胞（%）白細胞計數（×107/L）對照組 10 - 92.63±4.52 5.81±2.76 1.51±1.04 1.88±1.02模型組 10 - 69.71±10.45a 8.14±2.46b 22.13±5.14b 10.16±4.63b馬鞭草苷高劑量組 10 80 94.92±4.06c 3.11±1.18c 1.88±1.03d 2.17±1.24d馬鞭草苷中劑量組 10 40 90.38±3.92c 4.21±1.26c 5.35±1.37d 3.28±1.36d馬鞭草苷低劑量組 10 20 85.36±4.31c 5.18±1.87c 9.46±2.17c 5.20±2.33c地塞米松組 10 1.5 86.74±3.22c 4.39±1.92c 8.94±2.03c 5.12±2.46c

2.2 各組大鼠肺組織病理學變化情況比較 對照組大鼠肺組織形態正常，肺泡輪廓清晰，無炎癥細胞浸潤表現；模型組大鼠肺組織可見肺泡破壞程度較為嚴重，部分肺泡擴張，出現水腫、增厚等改變，炎癥細胞浸潤較為明顯；馬鞭草苷高、中、低劑量組與地塞米松組大鼠均有氣道上皮細胞破壞、炎癥細胞浸潤等改變，但損傷程度明顯低于模型組。（見圖1）

圖1 各組大鼠肺組織病理切片圖（HE，×200，標尺=20μm）

2.3 各組大鼠ASMCs增殖情況比較 與對照組比較，模型組大鼠G0/G1期細胞占比明顯降低，S期細胞占比明顯升高（P<0.05），A450值明顯增加（P<0.01）；與模型組比較，馬鞭草苷各劑量組和地塞米松組大鼠S期細胞占比明顯降低，G0/G1期細胞占比相對升高（P<0.05或P<0.01），A450值明顯降低（P<0.05或P<0.01）。（見表2）

表2 各組大鼠ASMCs增殖情況比較（±s）

表2 各組大鼠ASMCs增殖情況比較（±s）

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，dP<0.01

各期細胞占比（%）G0/G1期 S期對照組 10 - 78.52±6.64 12.03±2.84 0.14±0.37模型組 10 - 64.86±4.85a 22.18±3.66a 0.76±0.95b馬鞭草苷高劑量組 10 80 85.32±8.69c 9.68±2.47d 0.21±0.79d馬鞭草苷中劑量組 10 40 81.64±7.37c 11.73±3.36c 0.34±0.71c馬鞭草苷低劑量組 10 20 76.48±6.24c 14.59±3.48c 0.44±0.43c地塞米松組 10 1.5 79.54±7.16c 12.85±3.16c 0.36±0.68c組別 動物數（只） 給藥劑量（mg/kg）A450值

2.4 各組大鼠肺組織中RhoA mRNA表達及RhoA蛋白表達比較 模型組大鼠肺組織中RhoA mRNA表達及RhoA蛋白表達均明顯高于對照組（P<0.05或P<0.01）；馬鞭草苷各劑量組和地塞米松組大鼠肺組織中RhoA mRNA表達及RhoA蛋白表達均明顯低于模型組（P<0.05或P<0.01）。（見圖2、表3）

表3 各組大鼠肺組織中RhoA mRNA表達及RhoA蛋白表達灰度比較（±s）

表3 各組大鼠肺組織中RhoA mRNA表達及RhoA蛋白表達灰度比較（±s）

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，dP<0.01

組別 動物數（只）給藥劑量（mg/kg）RhoA mRNA表達RhoA蛋白表達灰度對照組 10 - 1.00±0.00 0.24±0.06模型組 10 - 2.21±0.11a 0.73±0.05b馬鞭草苷高劑量組10 80 1.25±0.58c 0.29±0.06d馬鞭草苷中劑量組10 40 1.36±0.34c 0.38±0.05c馬鞭草苷低劑量組10 20 1.72±0.12c 0.57±0.04c地塞米松組 10 1.5 1.44±0.09c 0.44±0.06c

圖2 各組大鼠肺組織中RhoA蛋白表達情況

2.5 各組大鼠肺組織NF-κB信號通路活性比較 與對照組比較，模型組大鼠肺組織NF-κBp65、p-NF-κBp65、p-IκBα水平明顯升高（P<0.05或P<0.01）；與模型組比較，馬鞭草苷各劑量組和地塞米松組大鼠肺組織NF-κBp65、p-NF-κBp65、p-IκBα水平明顯降低（P<0.05或P<0.01）。（見表4）

表4 各組大鼠肺組織NF-κB信號通路活性比較（±s，ng/L）

表4 各組大鼠肺組織NF-κB信號通路活性比較（±s，ng/L）

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，dP<0.01

組別 動物數（只）給藥劑量（mg/kg）NF-κBp65 p-NF-κBp65 p-IκBα對照組 10 - 39.54±5.18 13.82±2.12 11.15±2.03模型組 10 - 82.11±11.23b 43.28±5.31b 33.74±5.42a馬鞭草苷高劑量組10 80 43.58±6.45d 15.76±3.87c 14.65±3.47c馬鞭草苷中劑量組10 40 59.13±7.08c 22.54±4.32c 20.78±3.48c馬鞭草苷低劑量組10 20 68.64±8.62c 31.53±4.48c 26.86±4.43c地塞米松組 10 1.5 61.28±7.36c 24.82±4.56c 23.56±3.25c

2.6 各組大鼠肺組織MAPK信號通路活性比較 與對照組比較，模型組大鼠肺組織ERK1/2、JNK、p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK、p-p38MAPK水平明顯升高（P<0.05或P<0.01）；與模型組比較，馬鞭草苷各劑量組和地塞米松組大鼠肺組織ERK1/2、JNK、p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK、p-p38MAPK水平明顯降低（P<0.05或P<0.01）。（見表5）

表5 各組大鼠肺MAPK信號通路活性比較（±s，ng/L）

表5 各組大鼠肺MAPK信號通路活性比較（±s，ng/L）

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，dP<0.01

組別 動物數（只）給藥劑量（mg/kg）ERK1/2 JNK p38MAPK p-ERK1/2 p-JNK p-p38MAPK對照組 10 - 33.02±5.18 40.18±5.84 52.72±7.48 8.37±1.59 11.95±2.36 14.70±2.84模型組 10 - 54.79±6.85a 75.93±9.46a 95.62±9.84b 26.72±3.13b 36.42±4.89a 50.16±7.25a馬鞭草苷高劑量組 10 80 36.84±5.27c 43.26±6.04d 58.37±8.14d 11.35±1.62d 14.69±2.87c 18.58±5.93c馬鞭草苷中劑量組 10 40 43.49±5.37c 56.81±7.35c 70.43±8.40c 15.37±2.68c 21.48±3.12c 30.71±5.86c馬鞭草苷低劑量組 10 20 48.37±5.89 63.59±7.62c 78.94±8.63c 20.59±2.84c 26.63±3.85c 36.87±6.43c地塞米松組 10 1.5 46.56±6.14c 59.75±8.42c 72.68±8.72c 18.63±2.76c 24.69±3.46c 32.84±5.92c

3 討 論

氣道是呼吸系統抵御外界有害刺激的第一道防線，甲醛、煙霧等有害因素均可對氣道及肺組織造成損傷。氣道損傷發生后機體會進行再生與修復，修復完成后各種炎癥及細胞增殖便會得到有效抑制。支氣管哮喘是由免疫細胞因子及炎癥介質誘發的特異性炎癥性疾病，NF-κBp65與p38MAPK是發病與疾病進展的重要轉導機制。NF-κB是細胞內信號轉導的重要轉錄因子，通常情況下，由于IκB的抑制作用NF-κB在細胞質中處于非活性形態[9]。一旦IκB磷酸化NF-κB受到的抑制解除，NF-κB二聚體暴露出核定位序列（NLS），NF-κB會轉移至細胞核內與目的基因發生特異性結合，促進IL-5、IL-13等炎癥因子的基因轉錄，繼而提高炎癥因子的表達水平，促進支氣管哮喘的疾病進展[10]。MAPK是廣泛存在于細胞內的絲/蘇氨酸蛋白激酶超家族，可以將細胞質信號傳遞給細胞核并使之發生相應變化。MAPK信號通路包括p38MAPK、JNK、ERK1/2介導的級聯反應，細胞因子、高滲狀態、紫外線照射等細胞外信號均能激活MAPK信號通路，其能夠調控下游轉錄因子，并參與細胞生長、分化、凋亡、存活及各種炎癥反應，其活性增加可促進機體產生炎癥因子，擴大炎癥反應[11]。

ASMCs異常增殖是導致氣道重塑的一項重要原因，ASMCs過度增殖不僅會導致氣道狹窄、氣道管壁加厚，同時還會產生大量炎性細胞因子與趨化因子，加重機體的炎癥反應[12]。ASMCs增殖與細胞周期進展有著密切關聯，G1/S期與G2/M期是細胞周期的限制點，細胞在G1期對外界信號做出反應，若越過G1/S期這一限制點，細胞周期便可自主進行[13]。可見阻斷細胞完成正常的分裂周期有助于控制哮喘疾病進展，可以在一定程度上起到延緩甚至逆轉氣道重構的效果。Rho/Rock信號通路可以介導多種生物學行為，Rho蛋白是Ras超家族中的G蛋白成員，具有GTP酶活性。通常情況下以非活化Rho-GDP與活化Rho-GTP形式存在，活性RhoA可以使平滑肌發生收縮，從而影響細胞骨架的形態與結構[14]。Rock以Rokβ/Rockl和Roka/Rock2的形式存在于心、肝、肺等組織中，是Rho激酶下游靶效應分子。許多炎癥因子均能使Rho活化，ROCK與Rho通過磷酸化激活核因子與下游蛋白，完成肌動蛋白纖維與細胞骨架的組裝[15]。POSSA S S等[16]研究指出抑制Rho/Rock信號通路可以有效抑制5-HT誘導的大鼠ASMC過度增殖，使細胞周期停留在G0/G1期。此外，抑制Rho激酶活性還能減輕機體氧化應激反應，改善炎癥并延緩氣道重塑進程。可見Rho/Rock信號通路與ASMCs增殖、炎癥細胞遷移、哮喘疾病進展都具有密切關聯。

糖皮質激素是當前治療哮喘的一線藥物，其主要通過抑制氣道炎癥與ASMCs過度增殖，從而改善患者的疾病癥狀。但糖皮質激素治療不具備特異性，長期治療可能導致內分泌、代謝紊亂。馬鞭草苷是馬鞭草中的極性成分，屬于環烯醚萜苷類物質，具有保護心臟、促進血管新生等生物活性[17]。朱穎濤等[18]研究表明馬鞭草苷可以降低BALF中TNF-α、IL-4、IL-5等炎癥因子水平，并下調淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞百分比。同時降低大鼠肺泡間質炎性細胞浸潤程度，抑制ASMC過度增殖分化。司曉麗等[19]采用百合知母湯干預支氣管哮喘大鼠，光鏡檢查結果顯示大鼠肺組織可見少量炎癥細胞浸潤，且血漿中IL-2水平升高，IL-4水平降低，G0/G1期細胞占比提升，G2/M期與S期細胞占比減少，表明百合知母湯可以有效抑制外周淋巴細胞CaN活性，抑制淋巴細胞過度增殖，從而改善大鼠氣道炎癥。陳宏等[20]研究表明補益肺腎湯可以下調支氣管哮喘大鼠NF-κB、IL-2、IL-4、IL-5等炎癥因子水平，減輕氣道炎癥反應，改善大鼠預后情況。本次研究發現馬鞭草苷低、中、高劑量組白細胞計數和淋巴細胞、中性粒細胞百分比明顯低于模型組（P<0.05），巨噬細胞百分比明顯高于模型組（P<0.05），提示馬鞭草苷可以顯著改善支氣管哮喘大鼠氣道炎癥，降低機體的炎癥反應。對比各組大鼠肺組織病理變化情況可知，馬鞭草苷低、中、高劑量組大鼠肺泡受損程度較模型組明顯減輕，炎癥細胞浸潤程度明顯下降。模型組大鼠G0/G1期細胞占比明顯下降，S期細胞占比升高，提示ASMC增殖異常。馬鞭草苷低、中、高劑量組大鼠S期細胞占比明顯降低，提示ASMC增殖異常得到有效控制，大鼠哮喘疾病進程明顯延緩。觀察各組大鼠RhoA表達及NF-κB、MAPK信號通路活性可知，哮喘大鼠RhoA表達及NF-κB、MAPK信號通路活性均明顯升高。RhoA為NF-κB的上游基因，兩者表達水平呈正相關提示在支氣管哮喘發展過程中RhoA/Rho信號通路可能通過級聯反應激活下游NF-κB因子，促進機體產生大量炎癥因子，擴大機體的炎癥反應，加重疾病癥狀。馬鞭草苷可以有效抑制RhoA表達，并下調NF-κB、MAPK信號通路活性，抑制炎癥因子釋放并阻止ASMCs增殖，從而改善大鼠的氣道炎癥，緩解疾病癥狀。本次研究表明，不同劑量馬鞭草苷對支氣管哮喘大鼠的療效不盡相同，表現出一定的劑量依賴性，即馬鞭草苷劑量越高，對哮喘的治療效果越好。地塞米松的療效基本位于低、中劑量馬鞭草苷之間，提示中、高劑量馬鞭草苷對支氣管哮喘大鼠具有較好的治療效果。

綜上所述，馬鞭草苷可以有效減輕支氣管哮喘大鼠的氣道炎癥，抑制ASMC過度增殖與RhoA表達，從而改善大鼠的疾病癥狀，逆轉氣道重塑進程。其作用機制可能在于抑制NF-κB、MAPK信號通路活性，降低機體的炎癥反應。