木犀草素對慢性腎衰竭大鼠的保護作用

李秀文，李達麗

（新疆醫科大學第六附屬醫院，新疆 烏魯木齊 830000）

慢性腎衰竭是由于長期腎實質慢性、進行性的損傷導致的腎小球濾過率降低，由此引起腎臟內環境穩態及代謝功能發生紊亂而導致的一種臨床綜合征，是各種慢性腎臟疾病的最終結局，進而逐漸導致機體各器官功能衰竭而嚴重危及生命安全[1-4]。目前腎臟替代治療在慢性腎衰竭的治療中發揮了重要的作用[5]，但是在進行腎臟替代治療前如何采取有效治療措施延緩腎衰竭進展，保護殘存的腎臟功能具有至關重要的意義。炎癥是慢性腎衰竭重要的始動因素，持續的微炎癥狀態，促進了腎臟的纖維化及腎臟損傷，推動了腎衰竭的進展[6]。木犀草素是天然的黃酮類化合物，廣泛存在于許多天然植物中，包括菊花、薄荷、迷迭香、百里香、松柏植物和蕨類植物等，具有抗氧化、抗菌、抗炎癥等作用[7-8]，但是其對慢性腎衰竭是否具有保護作用的研究還較少，為此本研究擬探討木犀草素對慢性腎衰竭大鼠的保護作用，并研究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6~8周齡SPF級Wistar健康雄性大鼠30只，體質量160~180 g，購于卡文斯百格（蘇州）模式動物研究有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2018-0002，所有大鼠于18~24℃通風良好的SPF級動物房內適應性飼養1周。實驗經新疆醫科大學實驗動物倫理委員會批準，批準號：LFYLLSC20191209-01。

1.2 藥物與試劑 木犀草素（成都普利斯生物科技有限公司，貨號：M-007，含量＞98%）；羧甲基纖維素鈉（山東森美生物科技有限公司生產，貨號：FL20）；腺嘌呤（美國Sigma公司，貨號：A8626）；白介素-6（IL-6）試劑盒（貨號：ml102828）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（貨號：ml-002859）、尿素氮（BUN）試劑盒（貨號：ml-01049）、血肌酐（SCr）試劑盒（貨號：ml058879）（上海酶聯生物科技有限公司）；兔抗TLR4單克隆抗體（貨號：14358）、兔抗p-p65單克隆抗體（貨號：3031）、兔抗p-IκB單克隆抗體（貨號：76041）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，貨號：2118）、HRP標記山羊抗兔IgG二抗（貨號：7074）（美國CST公司）。木犀草素使用時加入羧甲基纖維素鈉溶液配制成200、50 mg/kg混懸液。腺嘌呤使用時加入雙蒸水配制成2.5%混懸液，放置在溫度為4℃的冰箱當中，混合均勻方可使用。

1.3 主要儀器DHG-9003型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海姚氏儀器設備廠）；LUX酶標儀、PCR儀、凝膠成像系統及定量PCR擴增儀（美國賽默飛公司）；移液槍、高速低溫離心機（長沙東旺實驗儀器有限公司）。

1.4 造模與分組 隨機選取21只大鼠進行慢性腎衰竭模型建立：配制2.5%的腺嘌呤混懸液，以200 mg/（kg·d）的劑量對大鼠進行灌胃，連續30 d，建立大鼠慢性腎衰竭模型[9]；另取9只大鼠作為對照組，用生理鹽水灌胃，于第30天隨機選擇3只對照組大鼠和3只模型大鼠處死，通過HE染色法觀察大鼠腎組織病理變化，從而判斷造模是否成功。造模成功后將18只大鼠隨機分為模型組、木犀草素高劑量組、木犀草素低劑量組，每組6只。

1.5 實驗給藥 木犀草素高、低劑量組大鼠分別用200、50 mg/kg木犀草素混懸液灌胃[10]，對照組和模型組大鼠用生理鹽水灌胃，持續灌胃15 d。

1.6 觀察指標

1.6.1 大鼠行為學觀察 給藥期間持續觀察各組大鼠飲食飲水狀態、大小便情況、體態、行動狀況、毛發顏色、毛發濃密情況；記錄造模期間各組大鼠的死亡情況。

1.6.2 ELISA法檢測大鼠血清IL-6、TNF-α、BUN、SCr含量 第15天給藥1 h以后，將大鼠按體質量0.01 mL/g注射1%的戊巴比妥鈉進行麻醉，取麻醉后的大鼠腹主動脈血5 mL，按照3 000 r/min的轉速進行離心，離心時間為15 min，離心取血清，采用ELISA法檢測大鼠血清IL-6、TNF-α、BUN、SCr含量。

1.6.3 HE染色觀察大鼠腎臟組織病理變化 各組大鼠分別脫頸處死，各取出部分腎組織，將腎組織分別用體積百分比為4%的多聚甲醛固定，石蠟包理，5μm厚連續切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后光鏡下觀察腎組織病理形態變化。

1.6.4 Western blotting法檢測大鼠腎臟組織中TLR4、p-p65、p-IκB蛋白表達水平 將蛋白樣品解凍以后，加等體積的2×SDS上樣緩沖液，在100℃溫度中煮沸5 min以達到蛋白變性的目的，然后按照40μg/孔進行加樣，采用SDS/PAGE凝膠電泳法進行電泳，將其轉移到PVDE膜，對膜進行封閉處理，然后加入兔抗大鼠TLR4一抗（稀釋度1∶200），放置在4℃恒溫環境中，放置過夜，再加入稀釋度為1∶10 000的二抗，放置在室溫環境中2 h，然后采用顯色劑進行顯色，顯色時間為1 min，隨后用蒸餾水進行洗滌，采集圖像并保存，采用凝膠圖像分析成像系統進行相關分析，將GAPDH作為內參，TLR4和GAPDH面積光密度比值代表TLR4蛋白表達情況。p-p65、p-IκB蛋白表達水平檢測方法同TLR4。

1.7 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，計量資料采用（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，采用SNK-q檢驗進行兩兩之間的比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠行為學觀察 對照組大鼠體型圓潤，動作靈敏，毛發細密有光澤，飲食及大小便正常，無死亡；模型組大鼠形態消瘦，動作遲緩，出現脫毛，且毛發粗糙無光，不思飲食，尿量較少，大便較稀，死亡2只；木犀草素低劑量組大鼠行為學與模型組無明顯差別，死亡1只；木犀草素高劑量組大鼠體型正常，比對照組大鼠動作略微遲緩，毛發暗淡，并無脫毛現象，飲食正常，大便較稀，無死亡情況。存在大鼠死亡的組別均選取相應數量大鼠在相同條件下進行重新造模和給藥補足數量。

2.2 各組大鼠血清BUN、Scr含量比較 與對照組比較，模型組及木犀草素低、高劑量組大鼠血清中BUN和Scr含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，木犀草素高劑量組大鼠血清中BUN和Scr含量明顯下降（P＜0.05）；木犀草素低劑量組大鼠血清中BUN和Scr含量與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠血清BUN和Scr含量比較（±s）

表1 各組大鼠血清BUN和Scr含量比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動物數（只）給藥劑量（mg/kg）BUN（mmol/L）Scr（μmol/L）對照組 6 - 6.93±0.44 37.02±1.23模型組 6 - 17.28±0.71a 180.83±9.26a木犀草素低劑量組6 50 16.55±0.69a 176.60±10.05a木犀草素高劑量組6 200 11.47±0.86a b 92.02±10.39a b

2.3 各組大鼠血清IL-6、TNF-α含量比較 與對照組比較，模型組及木犀草素低、高劑量組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，木犀草素高劑量組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量明顯下降（P＜0.05）；木犀草素低劑量組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠血清IL-6和TNF-α含量比較（±s）

表2 各組大鼠血清IL-6和TNF-α含量比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動物數（只）給藥劑量（mg/kg）IL-6（ng/L）TNF-α（ng/L）對照組 6 - 21.72±3.29 29.50±3.48模型組 6 - 61.24±4.49a 76.46±6.24a木犀草素低劑量組 6 50 58.61±3.56a 72.33±5.72a木犀草素高劑量組 6 200 38.99±3.32ab 42.54±3.93ab

2.4 各組大鼠腎臟組織病理變化 對照組大鼠腎臟體積正常，顏色為正常的深紅色；模型組大鼠腎臟組織體積增大，蒼白無血色，大量炎性浸潤，間質纖維化，腎小囊腔擴張嚴重；木犀草素高劑量組大鼠腎臟組織炎性浸潤較少，腎小囊腔呈現輕度擴張，間質纖維化程度較輕，腎臟組織有血色；木犀草素低劑量組大鼠腎臟病理情況與模型組基本一致。（見圖1）

圖1 各組大鼠腎臟組織病理變化（HE，×200）

2.5 各組大鼠腎組織TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白的表達情況 與對照組比較，模型組及木犀草素低、高劑量組大鼠腎臟組織TLR4、p-p65、p-IκB蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，木犀草素高劑量組大鼠腎臟組織中TLR4、p-p65、p-IκB蛋白表達水平明顯下降（P＜0.05）；木犀草素低劑量組大鼠腎臟組織TLR4、p-p65、p-IκB蛋白表達水平與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見圖2、表3）

圖2 各組大鼠腎組織TLR4、p-p65及p-IκB蛋白電泳條帶

表3 各組大鼠腎組織TLR4、p-p65及p-IκB蛋白表達比較（±s）

表3 各組大鼠腎組織TLR4、p-p65及p-IκB蛋白表達比較（±s）

注:與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動物數（只）給藥劑量（mg/kg）TLR4 p-p65 p-IκB對照組 6 - 0.10±0.01 0.21±0.02 0.15±0.02模型組 6 - 1.50±0.06a 1.50±0.06a 0.96±0.07a木犀草素低劑量組6 50 1.45±0.06a 1.48±0.05a 0.96±0.05a木犀草素高劑量組6 200 0.40±0.05ab 0.80±0.05ab 0.30±0.03ab

3 討 論

慢性腎衰竭病位主要在腎，且與脾緊密相關，最終可累及五臟六腑。中醫學中慢性腎衰竭的發病因素包括腎氣不足和感染風寒暑濕燥火六淫。現代醫學認為慢性腎衰竭的病理表現主要為腎臟纖維化，包括腎小球硬化、腎小管萎縮、腎間質纖維化等[11-12]。目前慢性腎衰竭的發病機制尚未完全闡明，其中炎癥反應會導致腎臟組織損傷并促進腎衰竭的進展已被證實[13]。研究發現[14]核轉錄因子信號通路能夠調控核內相關靶基因的轉錄或者表達，對炎癥介質的生成具有顯著影響，能促進炎癥反應發生，從而使得腎臟組織持續處于微炎癥狀態，導致腎臟組織纖維化，加劇腎臟損傷，促進腎衰竭的進展。

本研究發現模型組和木犀草素低劑量組大鼠均出現消瘦、脫毛、毛發粗糙無光，不思飲食，尿量較少，大便較稀，而木犀草素高劑量組和對照組大鼠狀態基本一致，只有動作略微遲緩、毛發暗淡現象，提示高劑量（200 mg/kg）木犀草素能夠明顯改善慢性腎衰竭大鼠行為狀態，降低死亡率。有研究表明，慢性腎衰竭導致腎臟功能受損，腎臟清除率降低，代謝產物、炎癥因子等不能有效排出體外，導致血液中代謝產物、炎癥因子等含量升高[15]。本研究發現，與對照組比較，模型組大鼠血清中BUN和Scr含量明顯升高，表明腎臟排泄代謝產物的能力降低，腎臟功能惡化[16]；而且模型組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量明顯升高，病理組織學觀察發現模型組大鼠腎臟組織體積增大，蒼白無血色，大量炎性浸潤，間質纖維化，腎小囊腔擴張嚴重，表明機體炎癥水平高，腎臟處于炎癥狀態，進一步加重了腎臟纖維化及腎臟損傷[17]。與模型組比較，木犀草素高劑量組大鼠血清中BUN、Scr、IL-6、TNF-α含量明顯下降，木犀草素低劑量組與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），病理組織學觀察發現木犀草素高劑量組大鼠腎臟組織炎性浸潤較少，腎小囊腔呈現輕度擴張，間質纖維化程度較輕，腎臟組織有血色，而木犀草素低劑量組與模型組病理情況基本一致，故200 mg/kg的木犀草素具有抗炎作用，可以提高代謝產物的清除功能，同時促進代謝產物排泄等，進一步減少炎癥因子在機體內的堆積，表明200 mg/kg的木犀草素可以明顯改善慢性腎衰竭大鼠腎功能損傷，減輕炎癥反應。

當腎小管受到氧化損傷以后，機體氧化應激機制啟動，活性氧的活性得到加強，導致TLR4/NF-κB信號通路發生活化，促進炎癥因子產生，加深氧化應激對腎臟的損傷，而且TLR4/NF-κB信號通路會促進腎小管上皮細胞轉變成間充質，由此使得腎小管上皮細胞失去正常功能，而具備了間充質的功能，導致腎臟發生纖維化，隨著病情進展，逐漸導致腎功能消失，出現腎衰竭，所以抑制TLR4/NF-κB信號通路對于減緩慢性腎衰竭的發生具有重要的意義[18]。TLR4/NF-κB信號通路激活和p-p65、p-IκB有關，因此可以通過檢測p-p65、p-IκB水平發現激活該信號通路的途徑[19-20]。本研究發現，與對照組比較，模型組大鼠腎臟組織TLR4、p-p65、p-IκB蛋白表達水平明顯著升高，TLR4/NF-κB信號通路被激活；與模型組比較，木犀草素高劑量組大鼠腎臟組織中TLR4、p-p65、p-IκB蛋白表達水平明顯下降，而木犀草素低劑量組與模型組比較無明顯變化。因此，200 mg/kg的木犀草素可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，改善慢性腎衰竭大鼠腎臟功能損傷。

綜上所述，200 mg/kg的木犀草素能夠改善慢性腎衰竭大鼠腎功能損傷，減輕炎癥反應，其機制可能是抑制TLR4/NF-κB信號通路。