葛根總黃酮聯合三氧化二砷體外誘導NB4-R1細胞凋亡的實驗研究

陳 婷，蔡亞云，沈 群

（1.如皋市人民醫院，江蘇 如皋 226500；2.南京中醫藥大學第一附屬醫院，江蘇 南京 210029）

急性早幼粒細胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）是急性髓細胞性白血病的特殊亞型。全反式維甲酸和/或砷劑[特別是三氧化二砷（As2O3）]成功誘導APL細胞分化或凋亡是白血病治療領域靶向治療的成功典范，使高危白血病成為真正意義上可以治愈的一種白血病，然而維甲酸綜合征和維甲酸耐藥是部分誘導治療失敗的根源。近年來，從傳統中藥中尋找開發新型抗腫瘤藥物已成為研究熱點。目前針對抑制早幼粒細胞耐藥細胞株NB4-R1增殖、誘導凋亡的特異性靶點的高效低毒的天然新藥，報道鮮少。葛根總黃酮是從葛根提取出的黃酮類化合物，近年來通過體內外實驗發現葛根總黃酮可以不同程度誘導多種白血病細胞株凋亡，已經證實了其抗白血病效應與凋亡通路密切相關[1-3]。本研究以低劑量葛根總黃酮（10、30、50μg/mL）和/或聯合As2O3（1μmol/L）體外誘導NB4-R1細胞凋亡，探討低劑量葛根總黃酮聯合As2O3對NB4-R1細胞增殖及凋亡的影響。

1 材 料

1.1 細胞系NB4-R1細胞由上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院惠贈，將NB4-R1細胞接種于約每瓶10 mL的含10%胎牛血清的RPMI1640培養基[含青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 U/mL）]中，置于恒溫細胞培養箱（37℃、5%CO2）中培養。

1.2 試劑 葛根總黃酮（南京澤朗生物有限公司，純度約為80%，貨號：FY1238）；二甲基亞砜（DMSO）（Sigma公司，貨號：D5879）；RPMI 1640培養基（Sigma公司，貨號：RNBH5043）；胎牛血清（GIBCO公司，貨號：10099-141）；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（Sigma公司，貨號：M2128）；Annexin VFITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒（凱基生物技術有限公司，貨號：KGA512）；As2O3溶液（哈爾濱伊達藥業有限公司，規格：10 mg，10 mL，貨號：2010-05-04）。葛根總黃酮溶于二甲基亞砜，-20℃保存，使用前用RPMI 1640培養基稀釋至工作濃度。As2O3溶液原液稀釋成1 mg/mL貯備液，-20℃下保存備用，使用前稀釋成所需濃度。

1.3 主要儀器 酶標儀（BioTek公司，型號：FLX800）；恒溫金屬浴（杭州博日科技有限公司，型號：HB-T1）；旋渦混合器（北京海天友誠科技有限公司，型號：QL-901）；電子分析天平（賽多利斯有限公司，型號：BSA224S）；CO2培養箱（日本三洋公司，型號：MCO175M）；超凈工作臺（Thermo Fisher公司，型號：51029704）；臺式超聲細胞破碎儀（無錫沃信儀器有限公司，型號：VOSHIN-250W）；超純水系統（美國Millipore公司，型號：Milli-RO Plus）；超低溫冰箱（日本三洋公司，型號：MDF-382E）；電泳儀（BIO-RAD公司，型號：CHEF-DR）；半干轉膜儀（BIO-RAD公司，型號：1703940）；高速離心機（德國Eppendorf股份有限公司，型號：5415D）；倒置顯微鏡（德國徠卡公司，型號：DMIL-PH1）。

2 方 法

2.1 MTT法檢測細胞增殖抑制率 取對數生長期細胞，以1×104/孔接種于96孔板，100μL/孔，加入葛根總黃酮，按照藥物終濃度分為空白組、葛根總黃酮10μg/mL組、葛根總黃酮30μg/mL組、葛根總黃酮50μg/mL組、As2O3組（1μmol/L）、葛根總黃酮10μg/mL+As2O3組、葛根總黃酮30μg/mL+As2O3組、葛根總黃酮50μg/mL+As2O3組，90μL/孔。分別培養24、48、72 h后，加入MTT溶液50μL，37℃孵育4 h，離心后去上清，加入100μL DMSO，室溫震蕩搖勻，酶標儀490 nm波長處測定吸光度（A490），實驗重復3次。計算細胞增殖抑制率（%）=[1-（實驗組A490-空白組A490）/（對照組A490-空白組A490）]×100%。

2.2 Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡 收集空白組、葛根總黃酮10μg/mL組、葛根總黃酮30μg/mL組、葛根總黃酮50μg/mL組、As2O3組（1μmol/L）、葛根總黃酮10μg/mL+As2O3組、葛根總黃酮30μg/mL+As2O3組、葛根總黃酮50μg/mL+As2O3組的NB4-R1細胞，調整細胞濃度為1×106/mL，1×PBS洗滌后調整密度為1×106/mL。加入500μL的Binding Buffer重懸細胞。加入Annexin V-FITC 5μL混勻后，加入PI 5μL，混勻，室溫、避光反應5～15 min，使用流式細胞儀進行檢測。

2.3 瑞氏染色 取對數生長期空白組、葛根總黃酮10 g/mL組、葛根總黃酮30μg/mL組、葛根總黃酮50μg/mL組、As2O3組（1μmol/L）、葛根總黃酮10μg/mL+As2O3組、葛根總黃酮30μg/mL+As2O3組、葛根總黃酮50μg/mL+As2O3組的NB4-R1細胞，1×PBS洗滌后調整密度為1×106/mL，棄上清，加入適量血漿，混勻后推片，晾干。瑞氏染色后顯微鏡下觀察細胞形態變化，并采集圖像。

2.4 流式細胞術檢測細胞周期 收集空白組、葛根總黃酮10μg/mL組、葛根總黃酮30μg/mL組、葛根總黃酮50μg/mL組、As2O3組（1μmol/L）、葛根總黃酮10μg/mL+As2O3組、葛根總黃酮30μg/mL+As2O3組、葛根總黃酮50μg/mL+As2O3組處理48 h的細胞，1×PBS洗滌，調整密度為1×106/mL，75%的冰乙醇（-20℃預冷）固定過夜，染色前用1×PBS洗去固定液，加入PIRnase A染液1 mL，渦旋混勻，室溫孵化30 min，用流式細胞儀檢測，并分析細胞周期，sub-G1為細胞凋亡群。

2.5 Western blottimg法檢測凋亡相關蛋白表達變化 收集空白組、葛根總黃酮10 g/mL組、葛根總黃酮30 g/mL組、葛根總黃酮50 g/mL組處理48 h的細胞，提取細胞蛋白，嚴格依照BCA蛋白定量試劑盒說明，完成樣品的制作與準備，進行蛋白濃度檢測。取40μg待測蛋白質樣品，行SDS PAGE電泳，電轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后加入一抗，4℃過夜，以TBST漂洗后，加入二抗，常溫孵育1 h，再經TBST漂洗，最后用顯色劑ECL試劑盒顯色、曝光、Photoshop6.0軟件分析結果。

2.6 統計學方法 實驗數據采用SPSS 25.0軟件進行統計，計量資料均以“均數±標準差”（±s）表示，各組數據符合正態性和方差齊性檢驗，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 各組NB4-R1細胞增殖抑制率比較 各組NB4-R1細胞培養24、48、72 h后，與空白組比較，發現其余各組具有不同程度的生長抑制作用，并隨著濃度增加、作用時間的延長，抑制率逐漸升高，與葛根總黃酮單用組比較，葛根總黃酮+As2O3組NB-R1細胞活力下降，凋亡更明顯，說明葛根總黃酮可呈濃度及時間依賴性抑制細胞的增殖，并與As2O3具有協同作用。（見圖1）

圖1 各組NB4-R1細胞增殖抑制率比較（±s，n=3）

3.2 各組NB4-R1細胞早期凋亡率比較 葛根總黃酮10μg/mL組、葛根總黃酮30μg/mL組、葛根總黃酮50μg/mL組NB4-R1細胞處理48 h后細胞早期凋亡率隨著濃度增加而增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；As2O3組和葛根總黃酮+As2O3組早期凋亡率呈劑量依賴性增加，差異有統計學意義（P<0.05）。（見表1、圖2）

表1 各組NB4-R1細胞處理48 h后細胞早期凋亡率比較（±s，n=3）

表1 各組NB4-R1細胞處理48 h后細胞早期凋亡率比較（±s，n=3）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與葛根總黃酮10μg/mL+As2O3組比較，bP＜0.05；與葛根總黃酮30μg/mL+As2O3組比較，cP＜0.05

組別 NB4-R1細胞早期凋亡率（%）空白組 1.40±0.20葛根總黃酮10μg/mL組 1.80±0.40葛根總黃酮30μg/mL組 6.70±0.50a葛根總黃酮50μg/mL組 8.30±0.70a As2O3組（1μmol/L） 1.90±0.30葛根總黃酮10μg/mL+As2O3組 4.40±0.46a葛根總黃酮30μg/mL+As2O3組 7.50±0.65a b葛根總黃酮50μg/mL+As2O3組 10.90±1.98a b c

圖2 各組NB4-R1細胞處理48 h的細胞早期凋亡率

3.3 各組細胞的形態學改變 處理48 h后，在油鏡下觀察發現未經藥物處理的NB4-R1細胞為圓形或橢圓形，細胞膜完整，核漿比高，呈圓形或者橢圓形，邊緣多有凹陷或折疊，染色質為紫紅色；隨著葛根總黃酮濃度增加，細胞發生不同程度的凋亡表現，其中葛根總黃酮30μg/mL+As2O3組和葛根總黃酮50μg/mL+As2O3組最為顯著，多數細胞可觀察到典型的細胞凋亡改變，可見細胞形態大小不一，細胞膜破裂，染色質變粗糙，濃縮，部分核仁消失，核漿比變小，染色質固縮、碎裂，并可見凋亡小體形成。（見圖3）

圖3 各組NB4-R1細胞的形態學改變（瑞氏染色，×1000）

3.4 各組NB4-R1細胞的細胞周期比較 葛根總黃酮（10、30、50μg/mL）作用后NB4-R1細胞周期發生變化，與空白組比較，葛根總黃酮30μg/mL組S期細胞增多，葛根總黃酮50μg/mL組G1期和S期細胞減少，提示葛根總黃酮能夠影響細胞周期進程，使細胞阻滯于S期；葛根總黃酮（10、30、50μg/mL）+As2O3聯合作用后，G1期細胞比例更少，S期細胞比例增加更明顯，細胞凋亡比例更大，葛根總黃酮50μg/mL+As2O3組出現明顯亞二倍體細胞，且葛根總黃酮+As2O3聯用組較單用葛根總黃酮組凋亡峰更明顯。（見圖4）

圖4 各組NB4-R1細胞的細胞周期比較

3.5 各組NB4-R1細胞凋亡相關蛋白表達比 較 葛根總黃酮50μg/mL組NB4-R1細胞JNK1及JNK2/3蛋白表達高于空白組、葛根總黃酮10μg/mL組、葛根總黃酮30μg/mL組（P＜0.05）；葛根總黃酮10μg/mL組、葛根總黃酮30μg/mL組、葛根總黃酮50μg/mL組NB4-R1細胞ERK1/2蛋白表達均低于空白組（P＜0.05），呈濃度依賴性，差異有統計學意義（P＜0.05）。（見圖5、表2）

圖5 各組NB4-R1細胞凋亡相關蛋白表達情況

表2 各組NB4-R1凋亡相關蛋白表達比較（±s，n=3）

表2 各組NB4-R1凋亡相關蛋白表達比較（±s，n=3）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與葛根總黃酮10μg/mL組比較，bP＜0.05，與葛根總黃酮30μg/mL組比較，cP＜0.05

組別 JNK1/β-actin JNK2/3/β-actin ERK1/2/β-actin空白組 0.22±0.52 0.16±0.06 0.38±0.13葛根總黃酮10μg/mL組 0.23±0.21 0.25±0.04 0.19±0.57a葛根總黃酮30μg/mL組 0.42±0.16 0.34±0.18 0.10±0.47a葛根總黃酮50μg/mL組 0.40±0.05abc 0.41±0.43abc 0.04±0.08abc F 18.099 24.220 59.785 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

4 討 論

急性早幼粒細胞白血病（APL）是一種特殊類型白血病，具有特征性的t（15、17）染色體和PML/RARa融合基因，出血傾向嚴重，易并發彌散性血管內凝血（DIC），故早期死亡率高[4]。全反式維甲酸（ATRA）與化療合理組合可以使得完全緩解率明顯提高，可是維甲酸耐藥成為ATRA治療APL的一大缺憾，部分患者對ATRA不敏感，還有部分患者發生高白細胞癥和維甲酸綜合征，應用As2O3治療可使對維甲酸耐藥或復發患者獲得高的完全緩解率，還可以獲得分子生物學緩解[5-6]。近幾年隨著砷劑、苦參堿、冬凌草甲素抗白血病治療成功的運用，尋找對人體無毒副作用而對腫瘤細胞有高度特異性作用的天然藥物研究成為熱點。

近年來很多體內外實驗發現葛根總黃酮可以不同程度誘導多種白血病細胞株凋亡，已經證實了其抗白血病效應與凋亡通路密切相關，葛根總黃酮處理NB4細胞后，細胞中外源性凋亡通路相關的FasL、Caspases-8蛋白，以及凋亡共同通路Caspase-3蛋白表達均上調，能活化該通路上游調控蛋白JNK、PARP，抑制抗凋亡蛋白激酶p38MAPK。進一步研究發現低劑量葛根總黃酮（10、30、50μg/mL）和/或聯合1μmol/L As2O3能體外誘導NB4細胞凋亡，觀察到隨著藥物濃度的增加，NB4細胞JNK表達逐漸增強。證明兩者有協同作用，推測葛根總黃酮可能是通過激活凋亡上游蛋白JNK，進一步激活促凋亡基因表達，激活凋亡信號。

本研究選用葛根總黃酮（10、30、50μg/mL）+1μmol/L As2O3處理NB4-R1細胞，光鏡、流式細胞儀均觀察到明顯的細胞凋亡，細胞周期顯示葛根總黃酮50μg/mL組G1期細胞比例下降，S期比例增加，尤其是葛根總黃酮50μg/mL+As2O3組細胞亞二倍體比例增加，顯示了誘導凋亡作用較強。早期凋亡檢測也顯示了相近的結果，即葛根總黃酮聯合或不聯合As2O3對NB4-R1細胞抑制作用呈濃度依賴性，單藥組早期凋亡率分別為（1.80±0.40）%、（6.70±0.50）%、（8.30±0.70）%；葛根總黃酮+As2O3聯合組早期凋亡率分別為（4.40±0.46）%、（7.50±0.65）%、（10.90±1.98）%，說明了低濃度葛根總黃酮（10、30、50μg/mL）+1μmol/L As2O3可以在一定程度上誘導NB4-R1細胞的凋亡，并且兩者具有協同作用。

細胞凋亡是區別于細胞壞死的、主動的、受多基因調控的程序化的死亡。在此過程中，細胞發生一系列生化改變，合成某些蛋白質，這些蛋白質的出現，使細胞某些基因開始表達，觸發細胞凋亡。為了進一步闡明葛根總黃酮誘導NB4-R1細胞凋亡的上游分子機制，我們選擇了與凋亡緊密相關的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen actived protein kinase，MAPK）調控系統中的相關分子做了更細致的研究。MAPK系統可以將細胞外信號轉導至細胞內或核內，引起諸如細胞增殖、分化、轉化及凋亡等生物學事件，目前已經在哺乳動物細胞克隆和鑒定了細胞外信號調節蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38等3個家族成員。其與細胞凋亡等密切相關[7]。蛋白印跡法發現葛根總黃酮可上調NB4-R1細胞中JNK表達，下調ERK1/2及p38表達。MAPK信號通路是細胞內主要的信號傳遞途徑之一，可調節多種細胞功能如細胞增殖分化、生存、死亡和轉化[8-9]。

JNK信號參與調節細胞增殖、凋亡及DNA損傷修復等多個細胞生命過程，通過蛋白激酶間的酶促磷酸化級聯反應實現JNK信號通路在多個層面上精密調控細胞間的聯系和凋亡[10-11]。研究表明JNK可通過磷酸化c-Jun和活化轉錄因子2，激活轉錄因子AP-1，促進細胞凋亡[10]，研究發現隨著藥物濃度的增加，NB4-R1細胞JNK表達逐漸增強。故推測葛根總黃酮可能是首先通過激活凋亡上游蛋白JNK，進一步激活促凋亡基因表達，激活凋亡信號，與文獻報道一致。

ERK1/2為細胞外信號調節激酶，又稱p44/42絲裂原活化蛋白激酶，為信號轉導的重要分子[12]，在惡性腫瘤細胞中，由于各種機制導致ERK過度活化，促進細胞增殖、抑制凋亡、促進細胞侵襲，影響細胞分化[13]。ERK能夠調控細胞增殖：細胞周期素D1是細胞周期G1/S調控點關鍵分子，其轉錄依賴于ERK的持續激活和核內滯留[14]。推測本實驗中ERK表達的下調可能引起NB4-R1細胞周期信號轉導通路發生改變，使NB4-R1細胞不能通過限制點，停滯于細胞周期進程，停止惡性增殖。

研究發現ERK的表達隨著藥物濃度增加，表達逐漸減弱，說明ERK并不是c-Jun的激酶，也不是死亡介導的蛋白，反而作為一個存活相關因子存在。有研究探討了番荔枝內酯化合物squamocin誘導白血病HL-60細胞凋亡的作用，發現藥物作用后細胞生長明顯受到抑制，磷酸化P44/42MAPK的蛋白量明顯減少[15]。研究結果與本實驗研究結果一致。ERK1/2對細胞凋亡的影響機制非常復雜，一方面可誘導編碼凋亡抑制蛋白基因的表達，誘導抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL的表達，還可以通過降低促凋亡蛋白Bad磷酸化，以及促進Bad、Bim降解，發揮抗凋亡作用。活化的ERK可在不同的微環境中發揮不同的作用，這可能是與其他通路共同作用、相互影響的結果[16-17]。

細胞的凋亡是一個復雜的過程，具有多樣性，細胞生存的微環境與細胞通路作用密切相關，即使同一信號通路對不同物種的細胞微環境及敏感度亦非完全相同，不同應激、不同細胞存在不同的信號轉導途徑，并且和其他通路可能相互串聯，從而發揮不同的生物學效應。本實驗中葛根總黃酮能夠同時調控凋亡相關通路MAPKs家族中的多個成員，推測葛根總黃酮誘導NB4-R1細胞凋亡可能存在多個靶點，可能激活細胞凋亡途徑中多個分子，或者此過程存在JNK、ERK兩個通路之間的交叉串聯，研究這一過程中相關分子信號的變化對細胞的惡化及藥物作用靶點具有重要意義，但機制復雜，仍需進一步研究。