HPLC-VWD-Q-TOF-MS/MS法定性與定量分析枳實梔子豉湯成分

趙 權， 張 優， 陳 影， 歐陽冰琛， 戴國梁， 居文政

(南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029)

枳實梔子豉湯源自東漢張仲景《傷寒論》393條，為醫治“發汗吐下后, 虛煩不得眠”并“勞復發熱”之良方[1]。全方由枳實、梔子、淡豆豉三味中藥所組成。其中枳實為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種或甜橙CitrussinensisOsbeck的干燥未成熟果實[2]；歸脾、胃經；理氣寬中、行滯消脹；梔子為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果實；歸心、肺、三焦經；瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒[3]。豆豉為豆科植物大豆Glycinemax(L.)Merr.的成熟種子的發酵加工品[4]；歸肺、胃經；解表，除煩，宣發郁熱。三藥合用，具有清熱除煩、解郁安神、改善失眠的功效，臨床上常用于治療熱擾胸嗝、氣機不暢、郁熱虛煩等癥狀[5-6]。

對中藥復方進行定性及定量分析，是保證其質量可控和療效穩定的重要手段。目前，已有對枳實梔子豉湯進行定性分析的文獻報道，但其定性結果未檢測到淡豆豉中的化學成分[7]。僅對枳實、梔子兩味藥材進行定性分析，分析結果具有一定的片面性，對后續可能的體內實驗不能全面指示枳實梔子豉湯發揮藥效的物質基礎。本實驗采用超高效液相-四級桿-飛行時間質譜儀(HPLC-Q-TOF-MS/MS)定性分析枳實梔子豉湯中的化學成分，以期為研究枳實梔子豉湯發揮藥效物質基礎的溯源提供參考。中藥復方化學成分復雜，種類龐雜，使用不當可能會引起毒性作用，所以中藥材相關化學成分的含量是否合格極為重要。檢索相關數據庫，尚未有對主成分進行同時定量分析的文獻報道，本實驗參考劉昌孝院士提出的中藥質量標志物確定原則[8]，采用HPLC法同時測定枳實梔子豉湯方中6種成分的含量，以期為其質量標準提供技術支撐和數據支持。

1 材料

1.1 儀器 LC(美國 Agilent公司)-Triple TOF TM 5600液相色譜-質譜聯用儀(美國 AB Sciex公司)，配有 PeakView(version1.2)數據處理軟件和質譜自動校準調諧系統(CDS)；Waters 2695高效液相色譜儀(配置Waters 2487 紫外檢測器)(美國Waters公司)；CPA 225D 電子天平(德國Sartorius公司)；Milli-Q Advantage A10超純水機(美國Millipore公司)；Legend Micro 17R 冷凍離心機(美國Thermo公司)；KH5200E 超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)；WH2 微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)。

1.2 試劑與藥物 京尼平龍膽雙糖苷(批號MUST-19102801)、梔子苷(批號MUST-17020401)、柚皮苷(批號MUST-17040102)、橙皮苷(批號MUST-16041806)、新橙皮苷(批號MUST-17040707)對照品(純度≥98.00%)均購自成都曼斯特生物科技有限公司；大豆苷(批號111738-201603)對照品(純度93.3%)購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇和乙腈(色譜純，德國 Merck公司)；甲酸(色譜純，瑞士 Fluka-Sigma-Aldrich公司)；磷酸(色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；TOF-MS 正離子調諧液(批號 4460131)、TOF-MS 負離子調諧液(批號 4460134)(美國 AB Sciex公司)。枳實(產地江西，批號171027007)、梔子(產地江西，批號180622016)、淡豆豉(產地河北，批號170531001)，均購自北京同仁堂南京分店，經江蘇省中醫院藥學部副主任藥師張倩鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

2.1.1 色譜條件 Agilent Poroshell 120 SB-C18色譜柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)；流動相0.1% 甲酸水(A)-甲醇-乙腈(1∶1)(B)，梯度洗脫(0～1.0 min，20%～25% B；1～3.5 min，25%～30% B；3.5～4.5 min，30%～48% B；4.5～6.5 min，48%～52% B；6.5～6.8 min，52%～60% B；6.8～9.5 min，60%～65% B；9.5～10.0 min，65%～90% B；10.0～11.5 min，90% B；11.5～12.0 min，90%～20% B；12.0～15.0 min，20% B)；體積流量450 μL/min；柱溫為40 ℃；進樣量10 μL；進樣室溫度4 ℃。

2.1.2 質譜條件 電噴霧離子源以正負離子模式采集數據, TOF-MS 掃描模式參數設置為分子量掃描范圍m/z60～1 500；累積時間 0.249 996 s; 離子化溫度(TEM)550 ℃；霧化氣(GS1)50 psi(1 psi=6.895 kPa); 輔助加熱氣(GS2)50 psi; 氣簾氣(CUR)35 psi; 去簇電壓(DP)80 V；碰撞能量(CE)10 eV；正負離子模式下噴霧電壓(ISVF)分別為5 500 V、4 500 V。采用信息關聯采集(Information dependent acquisition, IDA)、智能化的動態背景扣除(Dynamic background subtraction, DBS)和高靈敏度的模式采集數據。子離子掃描模式的參數設置為分子量掃描范圍m/z40～1 000；碰撞能量(35±15)eV, 其他主要參數同TOF-MS掃描模式。采用AB 公司的調諧液傳遞系統(CDS)對分子量準確度進行自動校準。通過AB公司的分析控制軟件Analyst? TF 1.6 software控制儀器操作和數據采集。

2.1.3 定量分析色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.1% H3PO4(B)，梯度洗脫(0～5 min, 2%～8% A; 5～15 min, 8%～15% A; 15～25 min, 15%～15% A; 25～35 min, 15%～20% A; 35～45 min, 20%～30% A); 檢測波長254 nm;進樣量10 μL; 柱溫35 ℃; 體積流量1.0 mL/min。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、大豆苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對照品適量，分別加甲醇制成含相應成分2.94、3.00、1.00、1.00、1.00、1.00 mg/mL的對照品貯備液，再分別吸取上述對照品適量，加甲醇配制成含相應成分30.39、79.51、6.677、173.1、44.27、139.6 μg/mL的混合對照品溶液，即得。

二是成立行動領導工作組。為提高工作認識，落實責任主體，成立由局長任組長，班子成員為副組長，各業務股室負責人為成員的工作組。同時，領導工作組下設業務小組，由分管領導為小組長，采購辦、財檢辦、行政政法股、科教文股、農財股、經建股、鄉財股、社保股、綜合股各派一名人員組成。

2.3 供試品溶液制備 將枳實15 g、梔子12 g、淡豆豉10 g放入1 L圓底燒瓶中，第一次加入10倍量的75%乙醇回流提取2 h，濾過，第2次加入8倍量的75%乙醇回流提取1 h。合并2次濾液，濃縮為1.332 g/mL的質量濃度，待用。精密吸取1 mL濃縮液于25 mL錐形瓶中，加入50%甲醇定容，搖勻，即得。

2.4 質譜分析 通過中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP)和相關文獻檢索各中藥材所含的化合物，根據PubChem Compound、ChemSpider獲得化合物分子式、分子量，查閱相關文獻，收集各化合物在正、負離子模式下的分子離子峰與二級碎片離子峰。PeakView軟件分析其總離子流圖，正、負離子總離子流圖見圖1。鑒定結果見表1。標準品二級質譜裂解圖見圖2。有標準品的化合物，則通過標準品進行比對。共鑒定出38個化合物。包括枳實15個化合物、梔子14個化合物，淡豆豉10個化合物，1個化合物為梔子和淡豆豉共有。主要包含環烯醚萜類、黃酮苷類、異黃酮苷類、有機酸類、黃酮類和異黃酮類。同一類型化合物具有相似的斷裂方式。

圖1 枳實梔子豉湯總離子流圖

表1 枳實梔子豉湯各化學成分鑒定分析結果

圖2 標準品二級質譜圖

2.4.1 環烯醚萜類 鑒定出的環烯醚萜類化合物均來源于梔子。以梔子苷(11)為例，通過PubChem Compound查詢其分子式C17H24O10，分子量388，在負離子模式下，碎片離子峰中有較強的m/z433的碎片離子峰，根據其碎片峰的質荷比，推測m/z433的碎片離子峰為[M+HCOO]-，可能是梔子苷。二級碎片離子m/z225[M-H-glc]-是由準分子離子峰[M-H]-脫去一分子中性碎片葡萄糖(162 Da)產生的，m/z225進一步發生RDA裂解，產生m/z123[M-H-Glc-C4H6O3]-的碎片離子峰。見圖3。

圖3 梔子苷質譜裂解過程

2.4.2 黃酮苷類 以柚皮苷(16)為例，柚皮苷為二糖苷類化合物，所含配糖基由鼠李糖與葡萄糖組成。正離子模式下，在一級質譜中顯示分子離子峰為[M+H]+m/z581，二級質譜中出現m/z435和m/z273的碎片離子峰。根據其化合物結構，m/z435為柚皮苷末端丟失中性碎片鼠李糖(146 Da)的碎片離子峰；m/z273為柚皮苷丟失整個糖基所得的碎片離子峰。其過程見圖4。柚皮蕓香苷等其他黃酮苷有著相似的斷裂方式。具體碎片信息見表1。

圖4 柚皮苷質譜裂解過程

2.4.3 異黃酮苷類 以大豆苷(12)為例，大豆苷化合物名稱為大豆苷元-7-O-葡萄糖苷，其結構是大豆苷元色原酮結構7號位通過氧苷鍵連接了葡萄糖形成的異黃酮苷類化合物。在負離子模式下，一級質譜中分子離子峰為[M-H]-m/z415。二級質譜可觀察到豐度較高的m/z252[M-H-Glc]-的碎片離子峰。鑒定出的異黃酮苷類大部分來源于淡豆豉，對染料木苷、黃豆黃苷等異黃酮苷類化合物也進行相應的鑒定。裂解過程見圖5。

圖5 大豆苷質譜裂解過程

2.4.4 有機酸類 以綠原酸(10)為例，在PubChem查詢其分子量后，推測其[M+H]+和[M-H]-分別為m/z355和m/z353。分別在正、負離子總離子流圖中找到相對應的分子離子峰，并核對其保留時間是否一致。在負離子模式下找到分子離子峰m/z353[M-H]-。其二級質譜中包含文獻中報道的m/z191[M-H-C9H6O3]-和m/z173[M-H-C9H6O3-H2O]-的碎片離子峰。在正離子模式下找到分子離子峰m/z355[M+H]-。對應的二級質譜中找到m/z163[M+H-C7H11O6]+的碎片離子峰，推測是由準分子離子峰脫去一分子奎尼酸所得，繼續脫掉一個CO得到m/z135[M+H-C7H11O6-CO]+的碎片離子峰。其具體裂解過程見圖6。

圖6 綠原酸在正、負離子模式的質譜裂解過程

2.4.5 黃酮類 以橘皮素(38)為例，在正離子模式下，根據橘皮素分子量推測m/z373是其分子離子峰。在二級質譜中找到m/z343[M+H-2CH3]+，m/z211[M+H-C10H10O2]+的碎片離子峰。與文獻[10]報道一致，因此確證橘皮素的存在。

2.4.6 異黃酮類 以大豆苷元(25)為例，負離子模式下，根據其分子量，推測m/z253應為其分子離子峰[M-H]-。二級質譜峰分別為224[M-H-CHO]-，208[M-H-CHO-CO2]-，133[M-H-C7H6O2]-。結合其參考文獻[11]，推測可能是大豆苷元。

2.5.1 專屬性試驗 在“2.1”項色譜條件下，取適量對照品、供試品溶液，精密吸取10 μL進樣分析。結果見圖2。由此可知，各物質分離度良好，京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、大豆苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷保留時間分別為12.37、14.55、17.94、33.78、35.65、37.92 min，分離度良好，色譜峰附近無其他成分的干擾，專屬性強，色譜圖見圖7。

1.京尼平龍膽雙糖苷 2.梔子苷 3.大豆苷 4.柚皮苷 5.橙皮苷 6.新橙皮苷

2.5.2 線性關系考察 精密量取“2.2”項下對照品儲備液適量，倍比稀釋成6個不同質量濃度，在“2.1”項色譜條件下進樣10 μL測定。以峰面積為縱坐標(Y)，質量濃度為橫坐標(X)進行回歸，結果見表2，可知各成分在各自線性范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系

2.5.3 精密度試驗 吸取“2.2”項下對照品溶液10 μL，在“2.1”項色譜條件下測定，連續進樣6次。測得京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、大豆苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面積RSD分別為0.70%、0.55%、0.35%、0.46%、0.92%、0.26%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩定性試驗 按“2.3”項下方法制備供試品溶液，室溫下于0、1、2、4、8、12、24 h，在“2.1”項色譜條件下測定，測得京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、大豆苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面積RSD分別為1.76%、0.80%、1.72%、0.99%、1.53%、0.88%，表明供試品溶液在室溫下24 h內穩定性良好。

2.5.5 重復性試驗 按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，在2.1”項色譜條件下進樣，測得京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、大豆苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量RSD分別為0.91%、0.97%、1.06%、0.93%、1.01%、0.88%，表明該方法重復性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗 按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，測定其含量，加入適量對照品貯備液，在2.1”項色譜條件下進樣，計算回收率，結果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結果(n=6)

2.5.7 樣品含量測定 按“2.3”項下方法平行制備供試品溶液，平行3份，在“2.1”項色譜條件下測定含量，結果見表4。

表4 各成分含量測定結果(mg/g，n=3)

3 討論

3.1 HPLC-Q-TOF-MS/MS定性分析 在流動相中，添加0.1%甲酸有利于黃酮類成分的峰形改善，也有利于某些成分如梔子苷產生響應更好的[M+HCOO]-分子離子峰。TOF-MS定性過程中發現，文中涉及到3組同分異構體(橙皮苷與新橙皮苷、橙黃酮與異橙黃酮、去乙酰基車葉草苷酸甲酯、雞屎藤次苷甲酯與羥異梔子苷)。有些同分異構體如橙皮苷與新橙皮苷，其分子離子峰一致，但其色譜行為不一致，因此在建立方法時，根據標準品的出峰時間，調整梯度使其在不同時間出峰，并比對標準品的二級碎片離子峰來進行鑒定。橙黃酮與異橙黃酮分子離子峰一致，可以根據出峰時間順序進行鑒定和區別[18]。文中還有一些同分異構體如去乙?；嚾~草苷酸甲酯、雞屎藤次苷甲酯與羥異梔子苷沒有標準品，因此，需要根據其出峰時間結合二級碎片離子峰加以判斷[16, 19-20]。

3.2 定量分析

3.2.1 成分選擇 枳實中的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷；梔子中的梔子苷；淡豆豉中的大豆苷等異黃酮類成分均具有抗抑郁的作用[21-23]。與方劑中解郁安神的功效基本一致。梔子中除2015年版《中國藥典》所規定的梔子苷作為指標性成分外，再增加一個藥材專屬性強且性質穩定的京尼平龍膽雙糖苷作為梔子的指標性成分。

3.2.2 色譜條件優化 比較Waters Xterra MS C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Waters Symmetry C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)3種色譜柱，最終選擇Agilent ZORBAX SB-C18柱。通過比較乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水和甲醇-乙腈-0.1%磷酸水4種流動相，結果發現乙腈-0.1%磷酸水作為流動相時峰形最優。實驗初期分別在238、246、254、270、283 nm進行檢測波長的比較。發現在254 nm條件下，分析物附近的雜峰較少，對于分析物的分離更有利。

3.2.3 進樣溶劑選擇 考察了純甲醇、75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇、純水作為進樣溶劑，發現50%甲醇作為進樣溶劑時各分析物分離良好，峰形最優。

本實驗應用HPLC-Q-TOF-MS/MS聯用技術，通過高分辨率質譜獲得化合物精確分子量、保留時間、碎片離子峰等信息，共鑒定出38個化合物。應用HPLC-VWD高效液相色譜法，建立了枳實梔子豉湯中6種成分同時測定的定量方法。對中藥復方進行定性及定量分析，以期為綜合評價枳實梔子豉湯的質量提供參考，為闡明其藥效物質基礎提供科學依據。