楊梅素抗抑郁作用及對神經遞質的調控機制

陶 靜， 周 銘*， 王玉婷， 熊 英

(1.武漢市肺科醫院藥學部，湖北 武漢 430030；2.武漢大學藥學院實驗中心，湖北 武漢 430070；3.武漢市第五醫院藥學部，湖北 武漢 430050)

近年抑郁癥患者數量不斷攀升，持續的心境低落導致的自殘、自殺等行為對社會和個人造成了嚴重危害[1]。抑郁癥的發病機制有多種，很多學者研究發現中樞系統神經遞質失衡，神經遞質如五羥色胺(serotonin，5-HT)、多巴胺(dopamine，DA)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)等的減少可能是導致抑郁的最主要原因[1-3]。目前，臨床治療抑郁癥的首選藥物是氟西汀，其主要是通過抑制突觸間隙對5-HT的攝取起效，且治療效果顯著[3-4]。為減少長期服藥帶來的毒副作用，尋找天然、有效的活性藥物治療包括抑郁癥、精神分裂癥等神經精神類疾病成為近年研究的熱點[5-8]。楊梅素(myricetin)主要存在于楊梅、山茶等植物中，其醇提物中富含大量楊梅素苷等物質，具有抗氧化、抗衰老等生理活性，其還可以通過血腦屏障，對預防神經退行性疾病等也有一定的功效[9-11]。然而，楊梅素是否具有抗抑郁作用尚不清楚，對慢性應激刺激誘導的下丘腦-垂體-腎上腺軸功能失調，逆轉5-HT等遞質的減少是否有調節作用也未見相關報道。因此，本研究通過復制小鼠慢性應激抑郁模型，采用懸尾實驗、強迫游泳實驗和曠場實驗評估楊梅素對抑郁小鼠行為學的影響，與此同時，采用高效液相色譜(HPLC)檢測中樞系統單胺遞質5-HT、NE、DA水平，熒光分光光度法檢測MAO活性，初步探討楊梅素抗抑郁作用機制，為后續進一步的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級昆明小鼠50只，雌雄各半，體質量20～25 g，8周齡，購自湖北省疾控中心，實驗動物生產許可證號SCXK(鄂)2008-0005，清潔級動物房飼養。

1.2 試劑與藥物 楊梅素對照品(美國Sigma公司，純度>96%，批號72576)；鹽酸氟西汀片(禮來蘇州制藥有限公司，批號2079A)。5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、司立吉林(MAO-B)、氯吉林(MAO-A)均購自美國Sigma公司(批號25002、1362500、H8502、M7441、M7316)。其他試劑均為分析純。臨用前，氟西汀、楊梅素分別用生理鹽水配制成1、5 mg/mL混懸液備用，并將后者稀釋1倍配制成低劑量(2.5 mg/mL)。

1.3 儀器 酶標儀(上海科華實驗系統有限公司，型號KHB ST-360)；水浴鍋(鄭州科華儀器設備有限公司，型號HH-600)；高效液相色譜儀(HPLC，日本島津公司，型號LC-20A)。

1.4 造模、分組及給藥

1.4.1 造模 采取文獻[6-7]報道的方法，每天下午15:00隨機給予小鼠晝夜顛倒(24 h)、禁食(24 h)、禁水(24 h)、4 ℃冰水游泳(5 min)、45 ℃熱烘(5 min)、潮濕飼養(潮濕墊料)慢性刺激中的1種，連續21 d，飼養環境為溫度(24±1)℃，相對濕度(60±10)%。

1.4.2 分組及給藥 50只小鼠隨機分成空白對照組，模型組，楊梅素高、低劑量組(50、25 mg/kg)，氟西汀組(10 mg/kg)，每組10只，除空白對照組外，其他各組小鼠造模同時每天上午灌胃給藥，劑量1.0 mL/100 g，連續21 d，空白對照組、模型組灌胃給予等量生理鹽水。

1.5 行為學評估

1.5.1 曠場試驗 參照文獻[6-7]，于實驗第7、14、21天灌胃給藥后1 h，將小鼠放入紙箱中(5×5格，500 mm×500 mm×300 mm)，記錄5 min內直立次數和水平穿過格數。直立次數標準為雙前爪同時抬起，水平穿過格數標準為有3只及以上爪子同時穿越1個格子。

1.5.2 懸尾實驗 參考文獻[6-7]，于實驗第7、14、21天灌胃給藥后1 h，將小鼠尾巴末端固定在1根橫木棒上，頭向下，身體倒立懸空，小鼠四周無攀抓物，觀察6 min內小鼠活動情況，并記錄后5 mim內小鼠懸尾不動的時間。

1.5.3 強迫游泳實驗 參考文獻[6-7]，于實驗第7、14、21天灌胃給藥后1 h，將小鼠置于1個高20 cm、直徑15 cm的透明容器內，提前注入(25±2)℃溫水，水位達12 cm時停止，觀察6 min內小鼠在容器中的游泳狀況，記錄后5 min內游泳不動時間，即小鼠漂浮在水面，偶爾移動或四肢沒有運動，僅頭露在水面以上的時間。

1.6 HPLC法測定小鼠大腦單胺遞質水平 于實驗第21天完成行為學實驗后，斷頭處死各組小鼠，冰上迅速剝離腦組織，稱定質量后置于冷凍管中保存，加入0.1 mol/L過氯酸(4 ℃預冷，含0.3 mmol/L的EDTA-2Na、0.5 mmol/L亞硫酸鈉)，冰上組織勻漿，置于4 ℃冰箱中避光靜置5 min后10 000 r/mim離心10 min，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，自動進樣20 μL，色譜條件參考文獻[12]，即Diammonsilim C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相100 mmol/L的枸櫞酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.0)-0.1 mmol/L EDTA-16%甲醇；體積流量0.8 mL/min；檢測波長275 nm。

1.7 熒光分光光度法檢測小鼠大腦單胺氧化酶活性 根據文獻[13]方法，冰上分離小鼠腦組織，稱定質量，按1∶9比例加入預冷磷酸緩沖液(pH 7.8，0.05 mol/L)組織勻漿，取2.5 mL磷酸緩沖液，依次加入0.4 mL 20%Triton、0.2 mL勻漿液，振蕩混勻后置于37 ℃水浴鍋中孵育10 min，加入1 μmol/L MAO-B或MAO-A抑制相應的MAO，再加入30 μL終濃度為22 μmol/L的底物，在37 ℃下孵育30 min，最后加入0.2 mL 5 mol/L高氯酸終止反應并離心，取0.5 mL上清液，加到2.5 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液中，采用熒光分光光度計測定最終產物4-氫喹啉的熒光強度(激發光318 nm，發射光380 nm)。

2 結果

2.1 楊梅素對抑郁小鼠行為學的影響 如圖1所示，與空白對照組比較，模型組小鼠7 d后水平穿越格數由(92.32±19.73)下降至(54.32±28.14)格，直立次數也由(21.45±16.81)次減少至(8.73±6.05)次，差異有統計學意義(P<0.01)，第14天及第21天，模型組小鼠水平穿越格數和直立次數均減少(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，給予25、50 mg/kg楊梅素后小鼠在曠場實驗中水平穿格數和直立次數均增加(P<0.01)，自主活動量恢復超過70%，接近氟西汀組。

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。

如圖2～3所示，第7天模型組小鼠懸尾不動時間較空白對照組從(91.06±22.14)s延長至(138.35±40.43)s，差異有統計學意義(P<0.05)，游泳不動時間為(190.36±27.65)s，較空白組延長了約70 s(P<0.05)，第14、21天，模型組小鼠懸尾和游泳不動時間幾乎是空白對照組的2倍；楊梅素干預后，第7天懸尾及游泳不動時間減少至90 s或更短，第14、21天，小鼠抑郁不動狀態得到改善，懸尾、游泳不動時間下降了50～100 s(P<0.05，P<0.01)，其中50 mg/kg楊梅素效果與10 mg/kg氟西汀類似。

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.2 楊梅素對小鼠大腦單胺遞質水平的影響 如表1所示，與空白對照組比較，模型組小鼠5-HT、NE、DA水平均降低(P<0.01)；與模型組比較，25、50 mg/kg楊梅素干預后小鼠腦內單胺類神經遞質5-HT、NE、DA水平升高(P<0.01)，以高劑量更顯著。

表1 各組小鼠大腦單胺類遞質水平

2.3 小鼠下丘腦單胺氧化酶活性 如表2所示，與空白對照組比較，模型組小鼠MAO-A、MAO-B活性升高(P<0.01)；楊梅素干預后，小鼠下丘腦MAO-A、MAO-B活性被抑制(P<0.05，P<0.01)，以高劑量組更顯著。

表2 各組小鼠下丘腦單胺氧化酶活性

3 討論

有研究采用慢性不可預知刺激大鼠后，其自主行為相關指標減少近30%，表明慢性不可預知刺激可造成動物抑郁行為[14]。本文得到了類似的結果，小鼠在曠場實驗中自主活動量減少了30%～50%，抑郁造模成功；這和張業奇等[7]研究結果一致，小鼠在不可預知刺激后反應遲鈍、動作緩慢，水平和直立活動均大幅度下降。懸尾實驗和強迫游泳實驗的不動時間長短可以反映小鼠的抑郁、絕望狀態。模型組懸尾實驗和強迫游泳實驗中不動時間明顯延長，表現出精神運動性抑制、興趣喪失等癥狀，與Jin[5]、張華林等[14]研究結果類似，說明小鼠在不可預知刺激后抑郁，自主行為減少。給予楊梅素干預后，抑郁小鼠自主活動明顯改善，懸尾和游泳不動時間縮短，楊梅素有效地預防并改善了小鼠抑郁狀態，且療效與劑量相關，這和許騰[8]、張華林[14]、Yu等[15]的研究結果相符，中藥類物質如皂苷、黃酮等改善抑郁行為具有一定的劑量依賴性，高劑量組抗抑郁效果優于低劑量組。本文首次發現楊梅素可以改善慢性應激刺激誘導的小鼠抑郁行為改變，證實其具有抗抑郁樣作用。

單胺遞質假說提出，中樞系統單胺遞質5-HT、NE、DA的缺乏是抑郁癥發生發展的重要基礎之一。下丘腦5-HT、NE和DA系統在生理活動的調控方面發揮了重要作用，具體包括睡眠、情緒及食欲等[16-17]；而其缺乏、不足會直接或間接影響中樞對應的5-HT受體、α/β受體、DA受體功能從而導致精神異常、抑郁情緒或遲滯行為[15-17]。大多數抗抑郁藥物都是通過提高大腦單胺遞質水平起效，在不同劑量藥物治療干預下，小鼠腦內單胺類神經遞質5-HT、NE和DA水平與模型組比較有了大幅回升，尤其是高劑量組小鼠單胺遞質水平回升更顯著。這可能得益于天然組分藥物作用于中樞系統如多巴胺受體、單胺氧化酶等發揮神經調節作用[18]，楊梅素也可使中樞5-HT、NE和DA等神經遞質上調發揮抗抑郁作用。

當大腦中樞MAO活性被抑制后，動物的抑郁狀態會得到改善[18]，MAO-A主要氧化降解去甲腎上腺素和5-HT；而MAO-B主要氧化降解多巴胺和兒茶酚胺等[19]。因此本文還檢測了各組小鼠大腦單胺氧化酶的活性變化，與Wang等[18]報道類似，楊梅素高劑量組小鼠下丘腦MAO-A和MAO-B活性明顯被抑制，說明中藥提取物可有效抑制中樞MAO活性，緩解單胺遞質耗竭。楊梅素通過抑制下丘腦MAO活性，使得中樞系統參與行為、情緒活動調節的神經遞質5-HT、NE和DA水平上升，進一步表明楊梅素對中樞系統的單胺神經遞質具有調節作用，可以逆轉應激刺激導致的中樞系統單胺遞質5-HT、NE和DA水平的下降。因此，楊梅素抗抑郁的作用可能是通過抑制MAO活性，上調中樞系統單胺遞質的水平起效的。

楊梅素能通過抑制大腦單胺氧化酶MAO活性，提高中樞系統神經遞質5-HT、NE及DA水平，從而增加抑郁小鼠自主活動量，縮短懸尾及游泳不動時間，改善小鼠的抑郁行為和遲緩呆滯狀態，起到抗抑郁樣作用。高劑量(50 mg/kg)楊梅素治療效果和10 mg/kg氟西汀相當，能夠預防并改善慢性應激誘導的抑郁樣行為，其可能的機制是抑制MAO活性，增加大腦中樞神經遞質5-HT、NE及DA的水平。