急性髓細胞白血病患兒血漿CD82、CD133表達水平與預后的關系

楊園園，方宗信，梁曉瀏

急性髓細胞白血病(AML)是一種血液系統惡性腫瘤，常起始于尚未分化成白細胞的骨髓細胞或其他類型造血細胞，主要臨床特征為原始腫瘤細胞大量增生引發的外周血象異常，患者常出現貧血、感染、異常出血、脾臟及淋巴結增大等臨床病理特征[1]。目前AML具體病因尚未明確，但研究人員普遍認為與環境和遺傳等因素密切相關[2]。隨著醫學技術的發展，AML治療后緩解率逐步提高，尤其是年輕和低危患者，其5年生存率甚至高達90%[3]。故通過相關特異性指標提示AML發生發展情況及預測患者預后具有重要意義。CD133表達水平與造血系統腫瘤有密切聯系，在AML、慢性粒細胞白血病等多種惡性血液病中均有表達[4]。另外，CD82被證實可有效抑制腫瘤轉移基因，其表達與不良預后密切相關[5]。研究表明，CD82在多種類型白血病中異常表達[6]。故本研究通過探究AML患兒血漿CD82、CD133表達水平與預后的關系，以期為臨床評估AML患兒預后提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧分析2016年6月—2021年6月在本院確診的88例AML患兒，男56例，女32例；年齡1～14(7.64±3.08)歲。納入標準：符合AML診斷標準[7]；年齡1～14歲；存活時間>6個月；臨床資料完整。排除標準：合并其他血液系統疾病或惡性腫瘤；合并嚴重肝、腎、心功能障礙；伴精神障礙；臨床資料不完整。

1.2試劑與儀器 實時熒光定量RT-PCR分析儀(瑞士Roche公司)；引物均由上海杏園瑞民生物工程有限公司合成；Trizol(美國Invitrogen公司);逆轉錄試劑盒(美國Bio-Rad公司);PCR擴增試劑盒購自杭州開泰生物技術有限公司；LH750型全自動血細胞分析儀(美國Beckman Coulter公司)。

1.3基因檢測 采集AML患兒靜脈血2 ml，加入EDTA抗凝，離心分離血漿，置于-80 ℃冰箱保存待測。向血漿樣本中加入Trizol 1 ml，采用Trizol法提取細胞總RNA，取總RNA 1 μg進行逆轉錄。按逆轉錄試劑盒說明書步驟將總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增。反應總體積10 μl，SYBR Green Premix Ex Taq 5 μl，上下游引物各0.5 μl，ROX Reference Byell 0.4 μl，cDNA模板1 μl，滅菌蒸餾水補足體系至10 μl，95 ℃預變性10 s，95 ℃變性10 s、65 ℃退火5 s、72 ℃延伸10 s，共40個循環。以β-actin為內參，重復實驗3次，取Ct平均值，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(β-actin)，ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組)。引物序列見表1。

表1 急性髓細胞白血病患兒基因檢測引物序列表

1.4血清學指標檢測 抽取所有患兒外周靜脈血2 ml，使用LH750型全自動血細胞分析儀檢測血小板(PLT)、白細胞(WBC)值。

1.5隨訪方法 記錄患兒家屬電話，3個月電話隨訪1次，隨訪截止至2021年6月，記錄所有患兒5年生存和無病生存情況。

2 結果

2.1不同臨床病理指標AML患兒5年存活情況 隨訪結果顯示，88例患兒死亡20例，失訪6例，存活62例。剔除失訪的6例，對82例AML患兒臨床病理指標進行單因素分析，結果顯示染色體核型、腫瘤轉移、WBC和PLT對患兒生存時間有明顯影響(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 不同臨床病理指標82例AML患兒5年存活情況(例)

2.2AML患兒存活Cox多因素分析 選擇影響AML患兒預后的變量進行賦值，生存時間≥5年=0，生存時間<5年=1；染色體核型正常=0，染色體核型異常=1；腫瘤未轉移=0，腫瘤轉移=1；WBC<15×109/L=0，WBC≥15×109/L=1；PLT<35×109/L=0，PLT≥35×109/L=1。結果顯示，染色體核型和腫瘤轉移是AML患兒存活的影響因素(P<0.05)。見表3。

表3 AML患兒存活Cox多因素分析

2.3存活影響因素與血漿CD82、CD133表達的關系 染色體核型異常的AML患兒血漿CD82和CD133表達水平明顯高于核型正常的AML患兒(P<0.01)；伴腫瘤轉移的AML患兒血漿CD82和CD133表達水平明顯高于未轉移的AML患兒(P<0.01)。見表4。

表4 AML患兒存活影響因素與血漿CD82、CD133表達的關系

2.4AML患兒血漿CD82表達與5年生存率和無病生存率的關系 以中位血漿CD82水平為基準，將患兒劃分為血漿CD82高表達(>370 pg/ml)組和血漿CD82低表達(≤370 pg/ml)組。血漿CD82低表達組5年生存率和無病生存率均明顯高于血漿CD82高表達組(P<0.05)。見表5。

表5 AML患兒血漿CD82水平與5年生存率和無病生存率的關系[例(%)]

2.5AML患兒血漿CD133表達與5年生存率和無病生存率的關系 以中位血漿CD133水平為基準，將患兒劃分為血漿CD133高表達(>46 pg/ml)組和血漿CD133低表達(≤46 pg/ml)組。血漿CD133低表達組5年生存率和無病生存率均明顯高于血漿CD133高表達組(P<0.01)。見表6。

表6 AML患兒血漿CD133水平與5年生存率和無病生存率的關系[例(%)]

3 討論

AML患兒骨髓中大量造血細胞不通過正常成熟過程，迅速繁殖產生大量異常血細胞，擠占正常細胞生存空間，白血病細胞亦可通過血液擴散至機體其他部位，形成腫瘤浸潤，導致各種白血病癥狀[8-9]。目前研究認為，AML的發生主要因相關染色體和基因在患兒生長發育過程中突變，且通常不局限于單一基因突變[10]。因早期AML完全緩解率高，患者預后較好，故臨床通過各類指標的相對變化來綜合評估AML情況和預后。本研究結果顯示，染色體核型、腫瘤轉移、WBC和PLT對AML患兒生存時間有明顯影響，說明可以通過監測上述指標對AML患兒綜合情況進行初步評估。研究表明，起病時高水平WBC與AML預后不良有關[11]。KIYOI等[12]研究顯示，高WBC的AML患兒治療后完全緩解率明顯降低，復發率明顯升高，生存期短。同時，AML發生轉移后，會累及全身各個器官，患者免疫功能急劇下降，影響患者治療效果與生存時間。

通過Cox多因素分析得出，染色體核型和腫瘤轉移是AML患兒存活的影響因素；且染色體核型異常的AML患兒血漿CD82和CD133表達水平明顯高于核型正常的AML患兒，伴腫瘤轉移的AML患兒血漿CD82和CD133表達水平明顯高于未轉移的AML患兒。說明可以通過觀察AML患兒血漿CD82和CD133水平，初步判斷患兒腫瘤轉移和核型異常情況，從而進一步預測患兒預后。既往研究表示，染色體核型與AML預后相關，60%的AML患者伴有染色體核型異常，異常染色體核型數量越多提示疾病越嚴重，復雜核型的AML患者完全緩解率較正常核型患者明顯降低[13]。免疫分型對白血病診斷和預后評估有重要作用，CD133是一種特異性造血干細胞標志物，在許多類型癌癥患者中高表達，且其高表達與預后不良息息相關。CD82主要參與調控白血病細胞增殖與黏附，因而在白血病的診斷和治療中發揮重要作用[14]。本研究結果顯示，血漿CD133、CD82低表達患兒5年生存率和無病生存率均明顯高于血漿CD133、CD82高表達患兒，提示當患兒血漿CD133、CD82高表達時病情較嚴重，預后不良可能性更高。

綜上，根據血漿CD82和CD133水平可初步評估AML患兒病情程度及預后。