miR-196a/LRIG3在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及對(duì)HCT116細(xì)胞增殖、侵襲的影響

任 松，劉雯菲，尚錦秀

全球每年有超過(guò)60萬(wàn)人死于結(jié)直腸癌(CRC)，CRC的高病死率與腫瘤轉(zhuǎn)移特別是肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道，近25%的CRC患者初診時(shí)存在轉(zhuǎn)移，其中約50%最終會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移[1]。為改善CRC患者的總體生存期，迫切需要在轉(zhuǎn)移性CRC中尋找新的生物學(xué)標(biāo)志物并及時(shí)給予干預(yù)措施。微小RNA(miRNA)通過(guò)與信使RNA(mRNA)的3-URT區(qū)結(jié)合，誘導(dǎo)mRNA降解或抑制轉(zhuǎn)錄后翻譯，其表達(dá)改變或功能障礙在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。miR-4775是CRC轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素，通過(guò)激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)/Smad7信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)CRC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。值得注意的是，CRC組織中miR-196a水平顯著高于鄰近正常結(jié)直腸黏膜，與CRC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)[4]。同時(shí)，miR-196a可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[5]。上述研究表明，miR-196a參與了CRC的病理過(guò)程，但其在CRC中的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。富含亮氨酸重復(fù)序列和免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域3(LRIG3)的染色體位于12q13.2區(qū)域，該區(qū)域是許多腫瘤最常見的基因缺失位點(diǎn)。研究表明，LRIG3基因在多種惡性腫瘤中低表達(dá)，但在CRC中的研究較少[6]。本研究通過(guò)檢測(cè)miR-196a在CRC組織中的表達(dá)，評(píng)估其對(duì)HCT116細(xì)胞增殖和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 HCT116細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù))；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒、miR-196a inhibitor和miRNA陰性對(duì)照(miR-NC)(上海吉?jiǎng)P生物公司)；Trizol試劑盒(美國(guó)Qiagen公司)；mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒(美國(guó)Promega公司)；四噻唑藍(lán)(MTT,美國(guó)Amresco公司)；細(xì)胞蛋白抽提試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；LRIG3、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)和β-actin抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗(武漢艾美捷科技有限公司)。

1.2組織來(lái)源 選取2019年1月—2020年12月在我院結(jié)直腸外科手術(shù)切除的原發(fā)性CRC患者42例，取癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)組織中miR-196a和LRIG3 mRNA的表達(dá) 取CRC組織，研碎后加入Trizol提取總RNA，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后在CFX-96 PCR擴(kuò)增儀中擴(kuò)增，反應(yīng)體系20 μl，反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s，擴(kuò)增60 ℃ 44 s、40個(gè)循環(huán)，以U6作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-196a和LRIG3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HCT116細(xì)胞，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、miR-196a inhibitor組和miR-NC組?？瞻讓?duì)照組在鋪板后48 h收獲細(xì)胞，miR-196a inhibitor組和miR-NC組分別按Lipofectamine2000說(shuō)明書將miR-196a inhibitor和miR-NC轉(zhuǎn)染到HCT116細(xì)胞，48 h后行相關(guān)檢測(cè)。

1.5MTT法檢測(cè)HCT116細(xì)胞增殖率 按照“1.4”方法轉(zhuǎn)染后接種于96孔板中，44 h后加入MTT(50 μl/孔)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入二甲基亞砜(200 μl/孔)振蕩，測(cè)定吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(miR-196a inhibitor組OD值-miR-NC組OD值)/空白對(duì)照組。

1.6Transwell法檢測(cè)HCT116細(xì)胞侵襲能力 按照“1.4”方法轉(zhuǎn)染后接種于Transwell小室中，下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，48 h后取出小室，去除上室內(nèi)細(xì)胞，4%甲醛固定10 min后用結(jié)晶紫染液染色30 min，沖洗干凈后在顯微鏡下計(jì)數(shù)紫色染色的穿膜細(xì)胞。

1.7Western blot法檢測(cè)HCT116細(xì)胞中LRIG3、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá) 按照“1.4”方法轉(zhuǎn)染后接種于6孔板中，48 h后收獲細(xì)胞，加入細(xì)胞蛋白抽提液提取蛋白，采用BIO-RAD系統(tǒng)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，切膠、轉(zhuǎn)膜、封膜后將膜與LRIG3(1︰300)、E-cadherin(1︰200)、N-cadherin(1︰200)和β-actin抗體(1︰500)進(jìn)行孵育，4 ℃過(guò)夜，用HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗(1︰5000)在室溫下孵育30 min，顯色，采集圖像分析。

2 結(jié)果

2.1miR-196a和LRIG3 mRNA在CRC組織中的表達(dá)及相關(guān)性 癌組織miR-196a mRNA的相對(duì)表達(dá)量高于癌旁正常組織[(1.05±0.27)vs(0.64±0.09)](P<0.05)；癌組織LRIG3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量低于癌旁正常組織[(0.88±0.13)vs(1.37±0.20)](P<0.05)。癌組織中miR-196a和LRIG3 mRNA水平與TNM分期、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05,P<0.01)。見表1。Pearson相關(guān)分析顯示，miR-196a和LRIG3 mRNA在CRC組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.442，P=0.013)。見圖1。

表1 miR-196a和LRIG3 mRNA在不同臨床病理特征結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)

圖1 42例結(jié)直腸癌組織中miR-196a和LRIG3 mRNA表達(dá)的相關(guān)性

2.2miR-196a靶向結(jié)合LRIG3 mRNA情況 為預(yù)測(cè)miR-196a的潛在靶點(diǎn)，本研究通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站(www.Targetscan.org)尋找miR-196a的潛在作用靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)miR-196a與LRIG3有潛在的結(jié)合位點(diǎn)。見圖2。

圖2 Targetscan軟件預(yù)測(cè)miR-196a與LRIG3 mRNA的互補(bǔ)配對(duì)系列

2.3miR-196a對(duì)HCT116細(xì)胞增殖和侵襲的影響 與空白對(duì)照組比較，miR-196a inhibitor組HCT116細(xì)胞增殖率和侵襲細(xì)胞數(shù)降低；與miR-196a inhibitor組比較，miR-NC組HCT116細(xì)胞增殖率和侵襲細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05)。見表2、圖3～4。

表2 miR-196a對(duì)HCT116細(xì)胞增殖和侵襲的影響

圖3 miR-196a對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響(MTT染色×100)A.空白對(duì)照組，B.miR-196a inhibitor組，C.miR-NC組

圖4 miR-196a對(duì)HCT116細(xì)胞侵襲的影響(結(jié)晶紫染色×100)A.空白對(duì)照組，B.miR-196a inhibitor組，C.miR-NC組

2.4miR-196a對(duì)HCT116細(xì)胞中LRIG3、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，miR-196a inhibitor組HCT116細(xì)胞中LRIG3和N-cadherin蛋白表達(dá)增加，E-cadherin蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與miR-196a inhibitor組比較，miR-NC組HCT116細(xì)胞中LRIG3和N-cadherin蛋白表達(dá)降低，E-cadherin蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。見表3、圖5。

表3 miR-196a對(duì)HCT116細(xì)胞中LRIG3、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)的影響

圖5 miR-196a對(duì)HCT116細(xì)胞中LRIG3、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)的影響A.空白對(duì)照組，B.miR-196a inhibitor組，C.miR-NC組；E-cadherin為E-鈣黏蛋白，N-cadherin為N-鈣黏蛋白

3 討論

研究顯示，超過(guò)50%的miRNA位于腫瘤相關(guān)基因組區(qū)域或易碎部位，對(duì)癌癥的發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮重要調(diào)控作用[7]。miR-196a最初被鑒定為一種直接靶向膜聯(lián)蛋白A1，是可促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的致癌miRNA[8]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-196a在口腔癌、宮頸癌、非小細(xì)胞肺癌等多種癌癥組織中均有異常表達(dá)，其表達(dá)水平與癌癥進(jìn)展相關(guān)[9]。一項(xiàng)臨床研究表明，miR-196a在CRC細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并且通過(guò)增強(qiáng)CRC細(xì)胞的侵襲及對(duì)鉑衍生物的敏感性而發(fā)揮促癌作用，同時(shí)其過(guò)表達(dá)加大了體內(nèi)CRC的肺轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[10]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是一個(gè)可逆過(guò)程，在包括CRC在內(nèi)的多種癌癥轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用。在此過(guò)程中，細(xì)胞會(huì)促進(jìn)E-cadherin蛋白表達(dá)并抑制間質(zhì)蛋白表達(dá)，使細(xì)胞間失去黏附性，獲得遷移和侵襲能力[11]。但miR-196a在CRC轉(zhuǎn)移過(guò)程中的明確調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，miR-196a在CRC組織中表達(dá)上調(diào)，且與TNM分期、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，同時(shí)通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)降低miR-196a表達(dá)后，靶向LRIG3調(diào)控EMT過(guò)程，最終抑制HCT116細(xì)胞增殖和侵襲。表明miR-196a參與了CRC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

miRNA的關(guān)鍵作用是通過(guò)與靶基因3-URT的互補(bǔ)，對(duì)mRNA分解和(或)抑制翻譯來(lái)調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)[12]。本研究顯示，miR-196a與LRIG3有潛在的結(jié)合位點(diǎn)。有研究通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-196a顯著降低野生型LRIG3質(zhì)粒熒光素酶活性，具有直接靶向作用[13]。同時(shí)，miR-196a過(guò)表達(dá)后可顯著降低宮頸癌Hela細(xì)胞中LRIG3蛋白表達(dá)，并當(dāng)miR-196a抑制劑組細(xì)胞再次轉(zhuǎn)染si-LRIG3時(shí)，發(fā)現(xiàn)LRIG3阻斷了miR-196a對(duì)宮頸癌細(xì)胞的促進(jìn)作用[14]。本研究結(jié)果也顯示，CRC組織中miR-196a和LRIG3 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這些研究進(jìn)一步證實(shí)了LRIG3是miR-196a的作用靶點(diǎn)。LRIG3在多種腫瘤中低表達(dá)，并與神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膀胱癌和宮頸癌轉(zhuǎn)移有關(guān)[15]。更重要的是，靶向LRIG3小分子抑制劑已顯示出較好的抗腫瘤活性[16]。

綜上，CRC組織中miR-196a表達(dá)升高，LRIG3表達(dá)降低，miR-196a表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致其靶標(biāo)LRIG3表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而抑制HCT116細(xì)胞增殖和侵襲。