肝細胞肝癌治療前后MRI-PWI參數、sFas、miR-224含量變化及對短期生存狀況的預測價值

朱 宏 鄭雪麗 黃寶生 王穎超 燕麗紅

（1.河西學院附屬張掖人民醫院；2.河西學院臨床醫學院，甘肅 張掖 734000）

據統計，肝細胞肝癌（Hepatocellular carcnoma，HCC）病死率居所有癌癥相關死亡的第2 位，嚴重威脅患者生命安全，給予HCC 患者及時有效治療尤為重要［1-2］. 目前經皮肝動脈化療栓塞術（Transcatheter hepatic arterial chemoembolization，TACE）在HCC 患者中應用價值受到臨床醫師廣泛認可，但對其療效評估方面存在一定爭議［3］.磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）是評估TACE療效的影像學手段之一，但其多依賴于腫瘤形態學改變評估療效，具有一定局限性.而磁共振灌注成像（MRI-perfusion weighted imaging，MRI-PWI）通過灌注參數值進行定量分析，能有效彌補MRI不足.可溶性Fas（Soluble Fas，sFas）是腫瘤壞死因子受體超家族成員之一，在HCC患者中呈過表達［4］.新近研究表明，微小RNA-224（microRNA-224，miR-224）可促進肝癌細胞增殖、遷移、侵襲，并抑制其凋亡［5］，但關于其與HCC患者療效、生存狀況關系尚需進一步探究.鑒于此，本研究選取89例HCC患者，觀察MRI-PWI參數、sFas、miR-224含量變化，分析其與療效、短期生存狀況關系，以期為臨床確定治療措施提供依據.

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018 年1 月～2019 年10 月我院89 例HCC 患者作為研究對象，（1）納入標準：符合《內科學》HCC診斷標準［6］，結合病理檢查確診；年齡18～80歲；Child-Puch分級B級、C級；均成功施行TACE；生存周期＞12周；患者及家屬知曉并簽署同意書；（2）排除標準：其他惡性腫瘤者；心腦血管疾病者；入組前4周接受免疫制劑治療者；MRI-PWI不耐受者.其中男48例，女41例；年齡18～80歲，平均（49.11±13.89）歲；體質量指數（BMI）18～25 kg/m2，平均（21.56±1.38）kg/m2；腫瘤數目：38例≥2個，51例＜2個；腫瘤直徑：35例≥5cm，54例＜5cm；分化程度：37例中高分化，52例低分化；Child-Puch 分級：49 例B 級，40 例C 級；微血管浸潤：37 例有，52 例無；淋巴結轉移：35例有，54例無.本研究經醫院倫理委員會審核批準.

1.2 方法

1.2.1 MRI-PWI 檢測 檢查前，禁食12h，仰臥位，叮囑受檢者胸式呼吸，應用GE Discovery MR 750 3.0 T MR掃描儀及8通道體部相控陣線圈，先行常規軸位T1WI、T2WI掃描，隨后經高壓注射液于肘前靜脈團注對比劑扎噴酸葡胺注射液，劑量0.2mmol/kg，速度4ml/s，同時追加20ml生理鹽水，更換至PWI模式，定位像為屏氣冠狀位T1WI，使用body線圈，快速擾相GRE序列，TE1.3ms，TR5.3ms，矩陣256×256，FOV34×26，層厚8.0mm，NEX1.0，間隔2.0mm，掃描時間3min，每3s進行1 次全肝采集.所得原始圖像上傳至AW4.3 工作站，以相關軟件處理，選取病灶橫截面積最大、信號最強的層面繪制感興趣區（ROI），獲得容積轉運常數（Ktrans）、血管外細胞外間隙容積比（Vc），所有數據連續測量3次，取均值.由2名高年資醫師盲法判斷，意見不統一時，請教上級醫師，得出統一結論.

1.2.2 血清指標檢測 （1）標本采集：清晨8：30～9：30，抽取4ml 外周靜脈血，分為兩份（各2 ml），靜置20min，以2500r/min速度離心15min，取上清液，-70℃保存備用.（2）sFas：應用全自動生化分析儀（日本日立公司，HITACHI7180型），以雙抗體酶聯免疫法測定血清sFas水平.由我院檢驗科醫師完全參照試劑盒說明書操作.（2）miR-224：取2ml 血清標本，參照德國Qiagen 公司提供miRNeasy 血清試劑盒提取總RNA，RNA 質量以分光光度計評估，所有洗脫RNA 樣品經DNA 酶Ⅰ（Sigma）處理；以miScriptⅡRT 試劑盒（Aiagen）逆轉錄成熟miRNA，參照Applied Biosystem 7500 實時RCP系統進行實時定量聚合酶鏈式反應（QRT-PCR），反應體系20 μl，反應條件：94℃預變性2min，94℃20s，60℃30s，60℃34s，共35～40 個循環反應，miR-224 引物：s：5，-GTCGTATC?CAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAAACG-3，as：5，-CGCAAGTCCTAGTG?GTTCCG-3，；U6引物：s：5，-CTCGCTTCGGCAGCACA-3，，as：5，-AACGCTTCACGAATTTGC?GT-3，，上述引物均由上海生工生物工程有限公司合成，每個miRNA的相對表達量用2-△△Ct表示，△△Ct=（CtHCC-miR224-CtHCC-u6）-（CtNC-miR224-ctNC-u6），每個樣本重復3次試驗.

1.2.3 治療方法 所有患者均行TACE，利多卡因（濃度2%）局麻，Terumo股動脈專用套管針進行一次性穿刺，置入5F動脈鞘管，先行腹腔動脈、肝總動脈及腸系膜上動脈常規造影，確定腫瘤大小、部位、血供，自腫瘤供血血管注入25mg吡柔比星+700mg氟尿嘧啶，同時將10mg吡柔比星與2 ml碘化油混合液與一定量明膠海綿顆粒栓塞靶動脈，每月1次，連用2次，術后常規給予保肝、抗生素、止痛等藥物.

1.3 療效評價

參照實體瘤療效評價標準評估，完全緩解（CR）：目標病灶動脈期增強顯影消失；部分緩解（PR）：目標病灶直徑總和縮小30%及以上；疾病穩定（SD）：目標病灶直徑總和縮小29%及以下；疾病進展（PD）：目標病灶直徑總和增大20%及以上，或出現新病灶.將CR、PR、SD 歸入穩定，PD歸入進展.

1.4 觀察指標

（1）HCC患者治療前、治療后4周MRI-PWI參數、血清sFas、miR-224水平.（2）不同療效患者治療前、治療后4周MRI-PWI參數、血清sFas、miR-224水平.（3）不同生存狀況治療前、治療后4周患者MRI-PWI 參數、血清sFas、miR-224水平.（4）MRI-PWI參數、血清sFas、miR-224水平單一或聯合預測HCC死亡價值.（5）MRI-PWI參數、血清sFas、miR-224水平與HCC患者死亡關系.

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 治療前后各指標

89例HCC患者治療后4周miR-224、sFas、Vc、Ktrans低于治療前（P＜0.05）.見表1.

表1 治療前后各指標（±s）

表1 治療前后各指標（±s）

時間治療前治療后4周n 89 89 t P Ktrans（min）1.36±0.25 0.42±0.11 32.468＜0.001 Vc（%）0.55±0.19 0.41±0.07 6.523＜0.001 sFas（μg/L）5.32±1.28 2.40±0.31 20.917＜0.001 miR-224 3.66±1.02 1.47±0.53 17.974＜0.001

2.2 進展及穩定患者治療前后各指標

治療前進展及穩定患者sFas、miR-224、Vc、Ktrans比較，無顯著差異（P＞0.05），治療后4周穩定患者miR-224、sFas、Vc、Ktrans低于進展患者（P＜0.05）.見表2.

表2 進展及穩定患者治療前后各指標（±s）

表2 進展及穩定患者治療前后各指標（±s）

時間n治療前組別穩定進展40 49 tP穩定治療后4周進展40 49 tP Ktrans（min）1.37±0.26 1.35±0.28 0.331 0.742 0.31±0.10 0.51±0.21 5.530＜0.001 Vc（%）0.56±0.17 0.54±0.18 0.535 0.594 0.27±0.06 0.52±0.12 11.999＜0.001 sFas（μg/L）5.34±1.25 5.30±1.28 0.141 0.888 2.23±0.28 2.61±0.34 5.783＜0.001 miR-224 3.67±1.01 3.65±1.04 0.091 0.927 1.30±0.48 1.61±0.57 2.737 0.007

2.3 生存及死亡患者各指標

治療后隨訪12 周，發現12 例死亡，77 例生存.治療前生存及死亡患者sFas、miR-224、Vc、Ktrans比較，無顯著差異（P＞0.05），治療后4周生存患者miR-224、sFas、Vc、Ktrans低于死亡患者（P＜0.05）.見表3.

表3 生存及死亡患者治療前后各指標（±s）

表3 生存及死亡患者治療前后各指標（±s）

時間n治療前組別生存死亡77 12 t P生存治療后4周死亡77 12 t P Ktrans（min）1.35±0.29 1.42±0.22 0.799 0.426 0.33±0.10 1.00±0.31 14.938＜0.001 Vc（%）0.54±0.21 0.61±0.14 11.114 0.268 0.30±0.09 1.12±0.35 2.830 0.006 sFas（μg/L）5.31±1.58 5.38±1.54 0.143 0.886 2.21±0.66 3.62±1.08 6.252＜0.001 miR-224 3.65±1.13 3.72±1.01 0.202 0.840 1.32±0.40 2.43±0.73 7.858＜0.001

2.4 單一及聯合預測HCC患者死亡價值

ROC 顯示，聯合預測HCC 患者死亡價值的AUC 為0.881（95%CI：0.795～0.940），診斷敏感度及特異度分別為83.33%、89.61%，其次為Ktrans 0.827（0.733～0.899）、Vc 0.811（0.714～0.886）、miR-224 0.805（0.708～0.882）、sFas 0.797（0.699～0.875）.見表4，圖1～2.

圖1 單一預測HCC患者死亡價值

表4 單一及聯合預測HCC患者死亡價值

圖2 聯合預測HCC患者死亡價值

2.5 各指標與生存狀況關系

根據ROC分析sFas、miR-224、Vc、Ktrans最佳截斷值分為高危組和低危組.KM曲線顯示，sFas、miR-224、Vc、Ktrans 高危組生存率低于低危組（χ2分別為8.667、6.489、4.680、6.782，P＜0.05）.見圖3～6.

圖3 sFas與生存狀況關系

圖4 miR-224與生存狀況關系

圖5 Vc與生存狀況關系

圖6 Ktrans與生存狀況關系

2.6 logistic回歸分析影響HCC患者死亡因素

以HCC患者是否死亡作為因變量，分化程度、腫瘤直徑、Child-Pugh 分級、腫瘤數目、微血管侵犯、淋巴結轉移、sFas、miR-224、Vc、Ktrans 作為自變量納入logistic 回歸模型，結果顯示，低分化程度、腫瘤直徑≥5cm、腫瘤數目≥2個、Child-Pugh 分級C級、微血管侵犯、淋巴結轉移、sFas≤2.50μg/L、miR-224＞2.06、Vc＞0.82%、Ktrans＞1.01min是影響HCC患者死亡危險因素（P＜0.05）.見表5.

表5 logistic回歸分析影響HCC患者死亡因素

3 討論

HCC是惡性程度最高腫瘤性疾病，易于復發和遠處轉移，因而臨床治療效果差，病死率高［7］.發病初期，HCC 患者無特異性臨床表現，確診時已屬中晚期，需采取TACE 等介入治療.TACE 作用機制是將抗癌藥物直接作用于病變部位，殺傷腫瘤細胞，結合栓塞可影響腫瘤細胞血供，導致腫瘤細胞死亡，但其無法完全殺傷腫瘤細胞，需行多次TACE，特別是瘤體巨大者［8-9］.如何客觀評價TACE療效，了解TACE介入術后腫瘤壞死程度，對臨床調整治療方案具有積極意義.

目前，TACE的療效判斷主要依賴于MRI，但常規肝臟MRI檢查序列多局限于形態學，隨醫學技術快速發展，影像醫學正從單純形態學逐步向形態學結合反映細胞、分子水平生理生化改變的功能學檢查發展［10-11］.PWI可無創性反映組織血管化程度及血流灌注情況，量化分析組織及腫瘤血管動力學方面信息，現已廣泛應用于神經系統、肌肉骨關節系統.傳統觀念認為，PWI易受脈搏、呼吸、腸道蠕動等因素影響，難以在肝臟、胃等腹部臟器廣泛應用［12］.近年隨磁共振快速及超快速成像序列開發及應用，成像時間、信噪比得到明顯改善，腹部磁共振灌注成像質量得到明顯提高，對實現磁共振肝臟灌注成像提供有利依據.本研究給予89例接受TACE 的HCC患者MRI-PWI檢查，結果發現，治療后4周Ktrans低于治療前，且穩定患者Ktrans低于進展患者（P＜0.05），與朱正［13］研究結果相符，提示Ktrans值越低，HCC患者TACE療效越好.Vc是對比劑在組織血管外細胞外間隙所占容積比，資料顯示，惡性腫瘤Vc值高于正常組織，并指出對TACE治療有效的腫瘤組織Vc值會降低［14］，究其原因在于，TACE 治療后，腫瘤血供受化療藥物、碘油填充破壞較大，壞死較徹底，腫瘤體積縮小更為明顯，Ktrans 及Vc值下降越明顯.本研究隨訪12周發現，生存患者Vc、Ktrans 低于死亡患者（P＜0.05），說明Vc、Ktrans 升高可能與HCC 患者生存狀況有關.ROC 顯示，Vc、Ktrans 升高可作為HCC 患者死亡預測指標之一. logistic 回歸分析顯示，Vc＞0.82%、Ktrans＞1.01min為患者死亡的獨立危險因素，提示MRI-PWI 參數升高會增加HCC 患者死亡風險，需及時給予相應治療.

HCC發生發展與細胞凋亡密切相關，而sFas可能是肝癌細胞凋亡途徑之一［15］.sFas可結合sFas配體，刺激半胱天冬蛋白酶，導致細胞發生蛋白水解，誘導肝癌細胞凋亡.亦有研究表明，原發性肝癌患者血中sFas水平高于健康體檢者［16］.sFas可抑制FasL誘導的淋巴細胞凋亡，增加體內激活淋巴細胞數量，參與原發性肝癌病理過程.魯玉娟等［17］研究指出，香菇多糖聯合TACE可降低原發性肝癌患者sFas水平.但目前關于HCC患者經TACE治療后sFas水平變化研究較少，故本研究對此進行分析，發現治療4周后血清sFas水平低于治療前，且穩定患者低于進展患者，可能與TACE治療后腫瘤病灶肝動脈及門靜脈供血得到治療有關，亦從側面反映高sFas 可能與HCC 患者TACE 治療療效有關.本研究還發現，治療4 周后生存患者sFas 低于死亡患者（P＜0.05），說明HCC 患者sFas持續升高會導致淋巴細胞凋亡延遲，加劇肝組織損傷，進而導致患者死亡.ROC 顯示，sFas 預測HCC 患者死亡價值的AUC 為0.797.logistic 回歸分析顯示，sFas 是HCC 患者死亡的獨立危險因素.上述結果均說明sFas水平越高，HCC患者死亡風險越大，建議臨床及時采取治療措施，以降低死亡率.

近年miR-224與腫瘤形成、復發轉移關系成為當前生物醫學研究熱點領域.相關研究指出，血清miR-224 在HCC 患者中平均表達量約為健康人的10 倍，推測是由于肝癌組織中高表達的miR-224 以一定方式釋放入外周血所致［18］.亦有學者發現，血清miR-224 濃度與肝癌組織濃度呈正相關，手術切除腫瘤組織后，其濃度明顯下降［19-20］.上述結果提示HCC患者血清miR-224濃度升高可能與腫瘤組織有關，但其釋放機制尚未清晰.本研究結果顯示，89例HCC患者治療后4周miR-224低于治療前，且穩定患者低于進展患者（P＜0.05），可能與TACE能縮小腫瘤體積，降低血清miR-224 水平有關，同時說明miR-224 有望成為評估TACE 療效的生物學標志物之一.另有研究報道，血清miR-224 與HCC 患者臨床分期、病理分化程度密切相關，可增加腫瘤侵襲性，引起腫瘤轉移，加劇病情進展，降低患者生存率［21］.本研究還發現，治療后4周生存患者miR-224低于死亡患者（P＜0.05），說明miR-224對HCC患者死亡具有一定預測價值.同時多因素回歸分析顯示，miR-224 是HCC 患者死亡獨立危險因素，有助于臨床醫師早期預測死亡風險，確定合理治療方案.此外，ROC 曲線顯示，聯合預測HCC 患者死亡價值的AUC 為0.881，提示臨床應重視MRI-PWI 參數、sFas、miR-224聯合預測HCC死亡價值，及時調整治療方案，降低HCC患者死亡風險.

綜上可知，HCC患者TACE治療后MRI-PWI參數、sFas、miR-224較治療前減低，聯合檢測能較好預測HCC患者生存狀況，為臨床診治提供科學依據.