婦科千金膠囊對LPS誘導RAW 264.7細胞炎癥及氧化應激的影響

胡櫻凡， 符 佳， 張 艷， 張 鵬， 張樂樂， 李 維， 鄒 亮， 龔 云*

(1.成都大學基礎醫學院，四川 成都 610106；2.株洲千金藥業股份有限公司，湖南 株洲 412007；3.成都大學食品與生物工程學院，四川 成都 610106)

婦科千金膠囊源于婦科千金方，由8味藥組成，千斤拔、功勞木共為君藥，穿心蓮、單面針為臣藥，雞血藤、當歸、黨參、金櫻根為佐藥，有清熱祛濕，益氣化瘀之效，主治濕熱瘀阻所致的帶下病、腹痛，臨床上廣泛用于治療慢性盆腔炎、子宮內膜炎、慢性宮頸炎[1-4]。婦科千金膠囊由株洲千金藥業股份有限公司生產，收載于2020年版《中國藥典》[5]。

婦科千金膠囊作為成方制劑，具有多成分、多靶點、多途徑的治療特點。已有研究報道，婦科千金方中千斤拔、功勞木、穿心蓮、雞血藤有明確的抗炎活性，且對其抗炎機制亦有一定的研究[6-11]。婦科千金制劑可通過調控NF-κB、PI3K/Akt等信號通路減少下游炎癥因子的分泌從而發揮抗炎作用[12-13]。環氧合酶-2(COX-2)是炎癥反應中的重要酶，為前列腺素家族介導物質[14-15]，COX-2抑制劑是理想的抗炎鎮痛藥物，有著巨大的臨床價值。此外，炎癥反應的同時發生的氧化應激不容忽視。炎癥反應中的巨噬細胞、中性粒細胞等活化以后，細胞耗氧量迅速增加，還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶大量激活，促使活性氧過量產生[16]；炎癥因子一氧化氮(NO)作為線粒體電子傳輸鏈的抑制劑可引起大量電子泄漏[17]，腫瘤壞死因子(TNF-α)可刺激白細胞產生大量活性氧，從而導致自由基大量產生以致氧化應激。另一方面，氧化應激可引起炎癥進一步加重。活性氧(ROS)促進花生四烯酸代謝，增加炎癥介質的形成；自由基可促進血漿趨化因子形成，吸引中性粒細胞向炎癥灶聚積。炎癥與氧化應激相互影響形成惡性循環，甚至引起器官衰竭、休克[18]。目前婦科千金膠囊是否通過COX-2發揮抗炎作用以及調控“炎癥-氧化應激”的藥效學機制尚不明確。因此，本研究擬基于體外炎癥模型，考察婦科千金膠囊對COX-2的調控作用，并探討其抗炎、抗氧化應激效應，為進一步研究和開發婦科千金膠囊提供實驗依據與參考。

1 材料與方法

1.1 藥物 婦科千金膠囊，購自株洲千金藥業股份有限公司，批號20181121。

1.2 細胞株 小鼠單核巨噬細胞株RAW 264.7，購于中國科學院上海細胞庫。

1.3 試劑 地塞米松磷酸鈉注射液(5 mg/mL，西南藥業股份有限公司，批號04132)；內毒素(LPS，美國Sigma公司，批號039M4004V)；DMEM高糖培養基(美國賽默飛公司，批號81119181)；四季青胎牛血清(浙江天航生物科技股份有限公司，批號19030604)；青霉素-鏈霉素、PBS緩沖液(美國HyClone公司，批號分別為J190005、AE25720265)；噻唑藍(MTT)試劑、格里斯(Griess)NO檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒、過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為042319190619、032519190612、052019191018、070319191022、071919191011)；小鼠TNF-α、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)酶聯免疫(ELISA)試劑盒及GAPDH單克隆抗體(杭州聯科生物技術有限公司，批號分別為A28290343、A20690543、A201B90324、A95370123)；iNOS rabbit mAb、COX-2 rabbit mAb(賽信通上海生物試劑有限公司，批號分別為13120S-4、12282S-4)；HRP-羊抗兔IgG+HRP-羊抗小鼠IgG、DMSO(武漢博士德生物工程有限公司，批號分別為BST13J17B26、PYG0040)；ECL超敏化學發光液(北京四正柏生物科技有限公司，批號4AH151911F)；丙二醛(MDA)、總谷胱甘肽/氧化行谷胱甘肽(GSH/GSSG)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)(南京建成生物工程研究所，批號分別為20191203、20191125、20191203)。

1.4 儀器 BPN-80CH(UV)CO2培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)；LWD200-37T倒置生物顯微鏡(上海測維光電技術有限公司)；SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；MX-S漩渦混勻儀、SLK-03000-SLED數顯圓周搖床(美國Scilogex公司)；SynergyHTX多功能酶標儀(美國Bio Tek公司)；TCS sp8 sted超高分辨激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)；CPA225D電子天平(德國Sartorius公司)；TD3低速自動平衡離心機、TGL-16臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。

1.5 方法

1.5.1 藥液制備 婦科千金膠囊去囊體、囊帽，稱取藥粉0.5 g，加入DMEM高糖培養基5 mL，旋渦，超聲，過除菌濾膜，即得(質量濃度為100 mg/mL)。

1.5.2 細胞培養 將RAW 264.7細胞在DMEM高糖培養基(含10%胎牛血清)中培養后，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中孵育。

1.5.3 MTT比色法檢測細胞活力 取對數生長期細胞，制成1×106/mL細胞懸液，接種于96孔板上，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養。設不含受試藥物的對照組及婦科千金膠囊1、5、10、20、40、60、80、100 mg/mL組，每組3個復孔，另設不含細胞，僅有培養基的空白組。培養過夜后，空白組、對照組加入100 μL新鮮培養液，婦科千金膠囊組加入100 μL不同質量濃度藥物的新鮮培養液，24 h后吸取培養液，PBS洗2次，各孔加入新鮮培養液90 μL、MTT(5 mg/mL)10 μL，繼續培養4 h，吸去上層液體，加入DMSO 100 μL，振蕩至晶體全部溶解，讀取490 nm處吸光度，計算細胞存活率。

1.5.4 RAW 264.7細胞NO、TNF-α、IL-6、IL-1β水平檢測 細胞以每孔500 μL(1.0×106/mL)接種至24孔培養板，培養過夜后，PBS潤洗，空白對照孔加入500 μL DMEM高糖培養基，地塞米松組加入等量高糖培養基(0.05 mg/mL)，實驗組加入含高、中、低劑量婦科千金膠囊藥液的DMEM高糖培養基各500 μL，0.5 h后加入LPS(1 μg/mL)，24 h后收集細胞上清液。采用Griess試劑盒檢測細胞上清液NO水平，采用ELISA試劑盒分別檢測其中TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.5.5 Western blot法檢測 RAW 264.7細胞iNOS、COX-2表達 1.0×106/mL細胞懸液以每孔2 mL接種至6孔培養板，培養過夜后，PBS潤洗，空白對照孔加入2 mL DMEM高糖培養基，地塞米松組加入等量培養基(0.05 mg/mL)，實驗組加入等量含高、中、低劑量婦科千金膠囊藥液的培養基，0.5 h后加入LPS(1 μg/mL)，24 h后棄細胞上清液，潤洗后加入含有PMSF的RIPA細胞裂解液，冰上充分裂解，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清，按比例加入5×loading buffer，100 ℃水浴5 min，迅速置于冰浴中冷卻，在-80 ℃下保存。采用Western blot法，檢測細胞中iNOS、COX-2蛋白表達，根據BCA試劑盒檢測樣品蛋白濃度，按每孔蛋白量100 μg上樣，100 V電泳，200 mA轉膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗按比例稀釋后4 ℃孵育過夜，次日TBST洗膜，二抗按比例稀釋后室溫孵育，TBST洗膜后取出，加入ECL超敏發光液，于暗室曝光采集信號，掃描后，采用Quantity One軟件分析。

1.5.6 RAW 264.7細胞ROS水平檢測 細胞以1.0×106/mL接種于24孔板，隨機分為空白對照組、活性氧對照組、模型對照組、地塞米松組及婦科千金膠囊高、中、低劑量組，培養過夜細胞貼壁后，空白對照組、模型對照組更換新鮮DMEM高糖培養基500 μL，活性氧對照組加入等體積含陽性對照試劑Rosup的DMEM高糖培養基(1∶1 000)，地塞米松組、婦科千金膠囊組加入對應質量濃度的等體積含藥培養基，30 min后除空白對照組、活性氧對照組外，其余各組加入LPS溶液(1 μg/mL)，繼續培養24 h后，裝載探針2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA，1∶2 000)，繼續孵育20 min，洗滌除去未進入細胞內的熒光探針，在激光共聚焦鏡下觀察拍照，并采用Image J圖像軟件進行分析。

1.5.7 RAW 264.7細胞MDA水平及GSH、CAT、SOD、GSH-Px活性檢測 將細胞制成懸液(1.0×106/mL)，接種于6孔板，隨機分為空白對照組、模型對照組、地塞米松組及婦科千金膠囊高、中、低劑量組，過夜后各組加入對應培養基，30 min后加入LPS溶液繼續培養24 h，去除上清液，PBS潤洗2次后，加入RIPA裂解液(含PMSF)在冰上裂解，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清，嚴格按照陳試劑盒說明書步驟檢測細胞裂解液中GSH、MDA水平及CAT、SOD、GSH-Px活性。

2 結果

2.1 婦科千金膠囊對RAW 264.7細胞活力的影響 如表1所示，與空白對照組比較，婦科千金膠囊10、20、40、60、80、100 mg/mL劑量組細胞存活率均低于40%，即對RAW 264.7細胞具有抑制作用。根據回歸分析可知，婦科千金膠囊對RAW 264.7細胞的半數抑制質量濃度(IC50)為7.178 mg/mL，故以IC25(2.104 mg/mL)為中劑量，分別確定4、2、1 mg/mL作為高、中、低劑量。

表1 婦科千金膠囊對RAW 264.7細胞活力的影響

2.2 婦科千金膠囊對RAW 264.7細胞NO、TNF-α、IL-6、IL-1β的影響 如圖1所示，與空白對照組比較，模型對照組RAW 264.7細胞NO、TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高(P<0.01)；與模型對照組比較，地塞米松組、婦科千金膠囊各劑量組均抑制NO、TNF-α、IL-6(除婦科千金膠囊低劑量組外)、IL-1β(除婦科千金膠囊低劑量組外)水平(P<0.05，P<0.01)。

注：與空白對照組比較，**P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.3 婦科千金膠囊對RAW 264.7細胞iNOS、COX-2蛋白表達的影響 由圖2所示，與空白對照組比較，模型對照組RAW 264.7細胞iNOS、COX-2蛋白表達上調(P<0.05)；與模型對照組比較，地塞米松組及婦科千金膠囊高、中劑量組均可抑制iNOS蛋白表達(P<0.05)，但僅地塞米松組對COX-2蛋白表達有下調作用(P<0.05)。

注：A為空白對照組,B為模型對照組，C為地塞米松組,D為婦科千金膠囊4 mg/mL組,E為婦科千金膠囊2 mg/mL組,F為婦科千金膠囊1 mg/mL組。與空白對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05。

2.4 婦科千金膠囊對RAW 264.7細胞ROS水平的影響 如圖3、表2所示，與空白對照組比較，模型對照組RAW 264.7細胞ROS水平升高(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組、婦科千金膠囊高劑量組對ROS水平具有抑制作用(P<0.05，P<0.01)。

表2 婦科千金膠囊對RAW 264.7細胞ROS水平的影響

圖3 各組RAW 264.7細胞ROS水平(×200)

2.5 婦科千金膠囊對RAW 264.7細胞GSH、MDA水平及CAT、SOD、GSH-Px活性的影響 如圖4所示，與空白對照組比較，模型對照組MDA水平升高(P<0.01)，GSH水平及CAT、SOD、GSH-Px活性降低(P<0.01)；與模型對照組比較，地塞米松組、婦科千金膠囊各劑量組MDA水平降低(P<0.01)，GSH(僅婦科千金膠囊高劑量組)水平及CAT(除婦科千金膠囊低劑量組外)、SOD(除婦科千金膠囊低劑量組外)、GSH-Px(除婦科千金膠囊低劑量組外)活性升高(P<0.05，P<0.01)。

注：與空白對照組比較，**P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3 討論

婦科千金膠囊是一種中藥復方制劑，其療效顯著，安全性好[19-21]，經濟成本低，在臨床上被廣泛用于盆腔炎、宮頸炎、陰道炎等多種婦科疾病的治療[4]。LPS為革蘭氏陰性細菌細胞壁成分[22]，可激活細胞炎癥信號通路，發生級聯反應，分泌大量炎性因子，引起炎癥反應[23]。此外，LPS可誘導細胞產生大量的ROS和自由基，打破氧化還原平衡，氧化應激進一步引起生物分子氧化損傷，導致釋放大量細胞因子、趨化因子，進而加重炎癥反應[16]。因此，氧化應激在研究炎癥反應時不容忽視。LPS誘導巨噬細胞釋放炎性介質的模型被廣泛應用于藥物抗炎、抗氧化應激的藥效評價與機制研究[24-26]，本研究利用該模型觀察婦科千金膠囊體外抗“炎癥-氧化應激”作用并初步探討抗炎機制。

TNF-α在模型對照組中迅速釋放，是炎癥組織中高表達的早期炎性因子之一[27]。在進一步誘發促炎細胞因子產生的過程中充當主要“信使”身份，是炎性細胞激活和募集的“核心”[28]。IL-6在炎癥初期可介導急性炎癥反應，當其作為促炎細胞因子傳遞炎癥信號時，IL-6為急性炎癥反應轉變為慢性炎癥反應提供基礎，因此，IL-6不僅是炎癥反應的標志指標更是治療炎性反應的潛在靶標[29-30]。IL-1β主要由單核細胞和巨噬細胞在炎性損傷中表達[31]，為原型促炎細胞因子，在疼痛、炎癥和自身免疫性疾病中有著重要作用。一氧化氮(NO)具有高膜滲透性，可快速透過細胞膜并擴散在各個組織中傳遞信號，不僅是炎癥特征指標，更是一種促炎因子[32-33]。一氧化氮合酶(NOS)有三種不同的異構體，其中iNOS在宿主細胞中生成大量的NO自由基，從而引起炎性疾病，甚至導致細胞死亡[34]。環氧合酶(COX)有3種同工酶，其中COX-2為誘導環氧合酶，在炎癥反應過程中，COX-2高度表達通過催化花生四烯酸氧化成前列腺素H(PGH2)，進而合成前列腺素E2(PGE2)誘發炎癥。因此，COX-2是一種炎癥反應的重要標志酶[14-15]。研究發現，婦科千金方中的藥物在體內體外均有顯著的抗炎活性。大葉千斤拔可抑制IκBα降解，下調iNOS蛋白的表達，降低LPS誘導巨噬細胞引起的TNF-α、IL-6、NO的釋放，并降低慢性盆腔炎大鼠血清中TNF-α、IL-6的濃度，改善子宮和輸卵管的炎癥[7]。穿心蓮成分穿心蓮內酯，可通過調節TLR4 mRNA的表達，抑制IκBα的降解與NFκB的活化，降低炎性因子TNF-α、IL-6的分泌，從而改善炎癥反應[11]。婦科千金制劑可通過下調NF-κB、PI3K/Akt信號通路，減少炎癥因子分泌[12-13]。

本研究基于LPS誘導RAW 264.7細胞建立體外炎癥模型，采用ELISA、Western blot等方法實驗發現，LPS誘導RAW 264.7細胞后，炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β、NO濃度升高，細胞中iNOS、COX-2蛋白的表達上調，與文獻報道一致[35-36]。不同質量濃度的婦科千金膠囊預處理LPS誘導的RAW 264.7細胞后，可抑制其分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β、NO水平，下調iNOS蛋白表達，且有劑量依賴性，表明婦科千金膠囊具有良好的體外抗炎活性，且可通過抑制iNOS蛋白的表達從而抑制NO的分泌，但婦科千金膠囊對LPS誘導引起的COX-2蛋白表達升高無抑制作用，表明婦科千金膠囊對下調COX-2蛋白表達的作用不明顯。

炎癥必然伴隨著氧化應激，活化的中性粒細胞耗氧量增加，活性氧自由基的大量生成，氧化程度超過氧化物清除能力，導致氧化系統與抗氧化系統失去平衡，產生大量脂質過氧化物產物，引起組織損傷[16]。機體的抗氧化系統，包括GSH、SOD、CAT、GSH-Px等。研究表明，婦科千金方中的藥物在體內體外均有顯著的抗氧化活性。Chiang等[37]研究發現大葉千斤拔提取物可有效清除紫外線誘導產生的ROS，具有抗氧化活性和抗光老化性能。Hsieh等[38]發現大葉千斤拔水提物可通過抑制增加大鼠肝組織的CAT、SOD、GSH-Px的活性從而減輕由四氯化碳引起的肝組織氧化應激，減輕肝損傷。何思蓉等[39]研究發現穿心蓮中的穿心蓮內酯通過調控HaCaT細胞中Nrf2/ARE通路發揮抗氧化作用。本研究發現RAW 264.7細胞經造模后發生明顯的氧化應激，ROS、MDA升高，GSH水平以及CAT、SOD、GSH-Px活性降低；而不同質量濃度的婦科千金膠囊可抑制其升高的ROS、MDA水平，并上調CAT、SOD、GSH-Px活性，且具有劑量依賴性，表明婦科千金膠囊具有抗氧化應激作用，從而保護LPS刺激巨噬細胞引起的細胞損傷。

綜上所述，婦科千金膠囊有良好的體外抗“炎癥-氧化應激”作用，可抑制LPS誘導的RAW 264.7細胞分泌TNF-α、IL-6、IL-1β、NO，并可通過抑制iNOS蛋白的表達抑制NO的釋放，但其無法下調COX-2蛋白表達以發揮抗炎作用；亦可抑制ROS、MDA的生成，上調GSH水平以及CAT、SOD、GSH-Px活性，增強抗氧化系統，發揮抗氧化應激作用。本研究為進一步闡釋婦科千金膠囊抗炎機制、抗氧化應激保護細胞損傷機制以及制劑開發、臨床應用提供了一定的實驗依據。