發情相關基因在小尾寒羊性腺軸組織中的表達分析

陳玉林 賀小云 劉玉芳 儲明星

摘要 [目的]探究綿羊繁殖性狀相關候選基因ATF4、CCNG1、KDM3B、NPTX1、PLCB3和RASD1在小尾寒羊性腺軸組織（大腦、小腦、下丘腦、垂體、子宮、卵巢、輸卵管）的表達差異，為闡明綿羊發情期調控分子機理提供理論依據。[方法]以FecB BB型小尾寒羊為研究對象，利用實時熒光定量PCR檢測上述6個基因在小尾寒羊黃體期和卵泡期與性腺軸相關的7種組織中的表達差異。[結果]ATF4在小尾寒羊黃體期卵巢組織中的表達量最高且極顯著高于卵泡期（P<0.01）;CCNG1在小尾寒羊黃體期卵巢組織中的表達量最高，在卵泡期大腦組織中的表達量極顯著高于黃體期（P<0.01）;KDM3B在小尾寒羊黃體期小腦中的表達量最高，且黃體期小腦和下丘腦中的表達量均顯著高于卵泡期（P<0.05）;NPTX1在小尾寒羊黃體期小腦中的表達量最高且顯著高于卵泡期（P<0.05）;PLCB3在小尾寒羊黃體期卵巢中的表達量顯著高于卵泡期（P<0.05）;RASD1在小尾寒羊卵泡期垂體組織中的表達量最高，在黃體期大腦、小腦、子宮中的表達量顯著高于卵泡期（P<0.05）。[結論]ATF4、CCNG1、KDM3B、NPTX1、PLCB3和RASD1基因可能對綿羊的發情期轉換起到一定的調控作用，為進一步闡明綿羊發情期轉換過程的分子機理提供了新思路，為進一步研究上述6種基因的功能奠定了理論基礎。

關鍵詞 綿羊;發情期;性腺軸;候選基因;組織表達

中圖分類號 S 826? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）21-0105-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.21.026

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Expression Analysis of Genes Related with Estrus in the Gonadal Axis of Small Tail Han Sheep

CHEN Yu-lin? HE Xiao-yun LIU Yu-fang 2 et al

（1.Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction of Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute of Animal Sciences， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193; 2.College of Life Science and Food Engineering， Hebei University of Engineering， Handan， Hebei 056001）

Abstract [Objective]To explore the expression differences of candidate genes（ATF4， CCNG? KDM3B， NPTX? PLCB3 and RASD1）related with the reproduction traits in the gonadal axis tissues （cerebrum， cerebellum， hypothalamus， pituitary， uterus， ovary， fallopian tube） of Small Tail Han Sheep，? so as to provide references? for elucidating the molecular mechanism of sheeps estrus regulation.[Method]Taking FecB BB Small Tail Han Sheep as the research object， real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression differences of the above 6 genes in 7 kinds of tissues related with gonadal axis of Small Tail Han Sheep in follicular phase and luteal phase， respectively. [Result] The expression of ATF4 in ovarian tissue of Small Tail Han Sheep in luteal phase was the highest and significantly higher than that in follicular phase （P< 0.01）. The expression of CCNG1 in the ovarian tissue of Small Tail Han Sheep was the highest in luteal phase of Small Tail Han Sheep， and its expression in the brain tissue in the luteal phase was significantly higher than that in the follicular phase（P< 0.01）. The expression of KDM3B in cerebellum of Small Tail Han Sheep in luteal phase was the highest， its expression in the cerebellum and hypothalamus in the luteal phase were both significantly higher than that in the follicular phase（P<0.05）.? The expression of NPTX1 in cerebellum in luteal phase was the highest and significantly higher than that in follicular phase（P<0.05）. The expression of PLCB3 in ovary of Small Tail Han Sheep in luteal phase was significantly higher than that in follicular phase（P<0.05）. The expression of RASD1 in the pituitary of Small Tail Han Sheep was the highest in the follicular phase， and the expression in the brain， cerebellum and uterus in the luteal phase was significantly higher than that in the follicular phase（P<0.05）.? [Conclusion]? ATF4， CCNG? KDM3B， NPTX? PLCB3 and RASD1 genes might play a certain role in regulating the estrus conversion of sheep， which provided a new idea for further elucidating the molecular mechanism of estrus conversion process in sheep， and laid the theoretical basis for further research on the functions of the 6 above genes.

Key words Sheep;Estrus;Gonadal axis;Candidate genes;Tissue expression

基金項目 國家自然科學基金項目（31772580）;國家肉羊產業技術體系專項（CARS-38）;中國農業科學院科技創新工程項目（ASTIP-IAS13）。

作者簡介 陳玉林（1997—），男，河南駐馬店人，碩士研究生，研究方向：動物遺傳育種。

*通信作者：劉玉芳，講師，博士，從事動物遺傳育種研究;儲明星，研究員，博士，從事羊優異繁殖性狀分子機理研究。

收稿日期 2021-01-30

排卵數和產羔數是決定綿羊繁殖力高低的重要因素。一般情況下綿羊排卵數為1～2個，但其數量不絕對，研究表明一些羊的排卵數在10個左右[1]。綿羊繁殖力受到復雜因素的調控，包括營養物質、遺傳因子以及羊群中的性別比例等，其中遺傳因素對綿羊繁殖力的影響較大[2]。通過對FecB基因的研究發現，攜帶該基因的母羊在排卵數方面存在劑量效應，即每增加一個拷貝數，其排卵數可增加1.5個，產羔數可增加1.0～1.5個[3-4]。該基因的發現為選育高繁殖力母羊提供了研究方向。發情期作為動物繁殖過程中的重要時期，具有研究遺傳因素對綿羊繁殖力作用機制的重大意義。近些年研究發現，發情相關基因ATF4、CCNG1、KDM3B、NPTX1、PLCB3和RASD1都對綿羊的繁殖力有一定的影響，探究這些基因在多羔綿羊發情期性腺軸相關組織中的表達差異對于闡明綿羊多羔分子機理具有重要意義。

前人研究發現，激活轉錄因子4（activiting transcription factor? ATF4）結合基序存在于多種時鐘基因中，包括PER2、PER3、Cry1、Cry2和Clock。ATF4與PER2啟動子結合并激活其轉錄，參與動物發情周期的調控過程[5]。大鼠卵巢ATF4敲除會導致卵母細胞數量減少，表明ATF4在排卵中有著以前未知的作用[6]。細胞周期蛋白G1（Cyclin G CCNG1）是一種細胞周期蛋白G家族蛋白，參與哺乳動物顆粒細胞增殖、卵母細胞成熟等繁殖生物學過程[7]。研究表明，CCNG1可能通過參與卵泡的生長發育，繼而達到對綿羊發情和季節性繁殖的調控[8]。組蛋白去甲基化酶3B（lysine demethylase 3B，KDM3B）基因敲除雌性小鼠發情周期延長，排卵能力下降，受精率下降，且在子宮中的胚胎植入位置也顯著減少，這可能是排卵和受精減少的結果[9]。KDM3B基因敲除雄性小鼠存在精子發生缺陷，并且由于生殖細胞中CREM介導的基因表達受損而導致不育[10]。因此，KDM3B是維持正常發情周期、排卵能力和受精效率所必需的。神經元正五聚蛋白1（neuronal pentraxin? NPTX1）是神經元發育的重要分泌蛋白，編碼神經元五肽 研究發現在GnRH神經元的誘導下NPTX1是最早激活的細胞外信號之一，該基因已被發現在松果體中存在晝夜差異表達（夜間表達量增加3.5倍），因此被認為是與生殖季節性表型相關的候選基因[11-12]。磷脂酶C β3（phospholipase C beta? PLCB3）是一種磷脂酶，在調節母體排卵、黃體生成、卵泡生長等方面發揮重要作用[13]。地塞米松誘導的Ras相關蛋白1（Ras related dexamethasone induced? RASD1）是Ras家族單體G蛋白的成員，在多種細胞功能中發揮核心作用，包括細胞增殖、分化、轉化、分泌和凋亡，另外研究表明其在下丘腦對神經元激活的反應中起重要作用[14]。此外，RASD1是一個雌激素反應的即刻早期基因（immediate-early genes），它還調控垂體雌激素反應晚期基因的表達[15]。

筆者利用實時熒光定量PCR技術對上述繁殖相關候選基因在綿羊不同繁殖時期（卵泡期和黃體期）性腺軸組織中的表達情況進行檢測，旨在為進一步揭示ATF4、CCNG1、KDM3B、NPTX1、PLCB3和RASD1基因的功能和解析綿羊繁殖機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品的收集

隨機選取2～3周歲健康、經產的空懷小尾寒羊卵泡期和黃體期母羊各3只，于2017年10月飼養于天津市畜牧獸醫研究所試驗羊場，所有試驗羊的飼養環境和飼料均相同，2017年11月進行屠宰，取其大腦、小腦、下丘腦、垂體、子宮、卵巢、輸卵管，取樣后迅速裝入1.8 mL RNase-Free凍存管中（最大樣品量為凍存管體積的2/3），所有樣品采集要在30 min內完成，樣品采集完迅速放入液氮中冷凍保存，用干冰帶回實驗室，放入-80 ℃冰箱中冷凍保存，備用。

1.2 RNA的提取及質量檢測

將采集的小尾寒羊卵泡期和黃體期性腺軸7種組織研磨后，用Trizol試劑（Invitrogen，美國）進行裂解，此后按照動物組織RNA提取試劑盒（天根，北京）的說明書進行總RNA的提取，最后利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000檢測提取RNA的質量和濃度。經檢驗合格的組織總RNA置于-80 ℃下保存備用。

1.3 引物設計

根據GenBank數據庫提供的綿羊ATF4、CCNG1、KDM3B、NPTX1、PLCB3、RASD1、RPL19基因序列（登錄號分別為NM_001142518.1、NM_001287473.1、XM_027970282.1、XM_004013084.4、XM_027959899.1、NM_001161872.1、XM_012186026.1）信息，并利用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計，以RPL19為內參基因。引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。各引物濃度均為10 μmol/L，引物序列詳細信息見表1。

1.4 cDNA的合成

利用TaKaRa反轉錄試劑盒（PK0445）合成cDNA，反轉錄體系如下：1.0 μL反轉錄混合引物，1.0 μL Oligo dT引物，1.0 μL隨機引物，4.0 μL熒光定量緩沖液，10 μL RNA，12.0 μL雙蒸水，全程在冰上操作。RT-PCR反應程序如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，將反轉錄完成后的cDNA產物稀釋后，用持家基因RPL19進行PCR檢測，質量檢驗合格后于-20 ℃下保存，以備檢測基因mRNA表達[16]。

1.5 實時熒光定量PCR

1.5.1 實時熒光定量PCR體系及反應程序。

PCR反應體系（總體積為20 μL）：10.0 μL熒光定量Ex Taq引物Ⅱ、0.8 μL上游引物、0.8 μL下游引物、2.0 μL cDNA 模板、6.4 μL雙蒸水。PCR反應程序如下：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性5 s，60 ℃ 30 s，40個循環;反應結束后進行熔解曲線分析[17]。

1.5.2 標準曲線的建立。

將cDNA樣本5倍稀釋后，進行2倍梯度稀釋后獲得5個濃度梯度（1、1/2、1/4、1/8、1/16）的cDNA樣品。用這些cDNA作為模板，對目的基因和持家基因進行熒光定量PCR，以濃度梯度的對數值（以10為底數）為橫坐標，以Ct值為縱坐標，繪制目的基因和持家基因的標準曲線。

1.5.3 實時熒光定量檢測與數據分析。

使用Roche Light Cycler480 Ⅱ 型熒光定量PCR儀進行熒光定量檢測，采用Excel軟件進行數據處理，用2-△△Ct的方法計算基因的相對表達量。獲得的表達量數據使用SPSS 19.0軟件進行獨立樣本T檢驗。

2 結果與分析

2.1 RNA的提取

提取后的總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果發現28S條帶明顯亮于18S條帶，條帶完整性較好，表明該RNA質量合格，可用于后續試驗。

2.2 ATF4、CCNG1、KDM3B、NPTX1、PLCB3、RASD1基因組織表達分析

2.2.1 ATF4基因組織表達檢測。

實時熒光定量PCR結果顯示，ATF4基因在7種組織中均有表達，其中在小尾寒羊黃體期的卵巢組織中的表達量最高且極顯著高于卵泡期（P<0.01）;ATF4基因在其他組織中的表達量差異均不顯著（P>0.05）（圖1）。

2.2.2 CCNG1基因組織表達檢測。

小尾寒羊2個繁殖時期的7種組織中，CCNG1基因在小尾寒羊黃體期卵巢組織中的表達量最高;CCNG1基因在卵泡期大腦組織中的表達量極顯著高于黃體期（P<0.01），但其在其他組織中的表達量差異均不顯著（P>0.05）（圖2）。

2.2.3 KDM3B基因組織表達檢測 。

如圖3所示，KDM3B基因在小尾寒羊黃體期小腦組織中的表達量最高;KDM3B基因在黃體期小腦和下丘腦組織中的表達量顯著高于卵泡期（P<005）;KDM3B基因在其他組織中的表達量差異均不顯著（P>0.05）。

2.2.4 NPTX1基因組織表達檢測。

如圖4所示，NPTX1基于在小尾寒羊黃體期小腦組織中的表達量最高且顯著高于卵泡期（P<0.05）;NPTX1基因在其他組織中的表達量均無顯著差異（P>0.05）。

2.2.5 PLCB3基因組織表達檢測。

如圖5所示，PLCB3基因在小尾寒羊2個繁殖時期卵巢組織中的表達量均最高，黃體期卵巢組織中該基因的表達量顯著高于卵泡期（P<005），其在其他組織中的表達量無顯著差異（P>0.05）。

2.2.6 RASD1基因組織表達分析。

如圖6所示，RASD1基因在小尾寒羊卵泡期垂體組織中的表達量最高;在黃體期大腦、小腦、子宮中該基因的表達量顯著高于卵泡期（P<005），而其在卵泡期卵巢、子宮、輸卵管呈痕量表達。

3 討論

哺乳動物的繁殖性能受到復雜的激素和分子網絡的調節，其中下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸是最基本和最重要的調節途徑，也起到調節生殖功能的關鍵作用[18]。研究表明，對小鼠、綿羊、斑馬魚和三穗鴨等的研究發現相關基因能夠影響性腺軸，從而參與到繁殖的調控之中[19-22]。發情期是動物繁殖的重要環節，研究動物發情期的調控機制對于動物繁殖力的提高具有重要意義，因此探究發情相關候選基因在性腺軸組織中的表達差異對于闡明小尾寒羊高繁殖力的機理具有一定的促進作用。

ATF4是一種應激性轉錄因子，又稱環腺苷酸（cAMP）連接效應元件2（cREB2），與氨基酸轉運和代謝、抗氧化應激、蛋白質穩態和鈣釋放密切相關，也可以誘導細胞凋亡、細胞周期阻滯和衰老，是內質網重要的調節因子，且在早期胚胎發育中起著十分重要的作用[23]。研究發現，ATF4可以結合VEGF啟動子中發現的4種氨基酸反應元件來上調VEGF表達，增加新生血管的形成[24]。該試驗發現ATF4在小尾寒羊性腺軸的7種組織中均有表達，且黃體期卵巢中的表達量顯著高于卵泡期，由于黃體形成過程中伴有血管生長，因此推測其通過促進卵泡膜內層毛細血管的生長，從而促進小尾寒羊黃體的形成，在黃體期至卵泡期的轉變中起到調控作用。

細胞周期蛋白G1（CCNG1）是細胞周期蛋白G1/MDM2/p53軸的關鍵組成部分，其表達與促進生長和細胞周期進程相關[25-26]。研究發現，該基因在發情期和發情后期卵巢中的表達量存在顯著的品種間差異，因此推斷其可能通過參與卵泡的生長發育，繼而達到對綿羊發情和季節性繁殖的調控[8]。該試驗中CCNG1基因在小尾寒羊性腺軸7種組織中均有表達，與前人研究結果相符合，且2種時期大腦組織中的表達量存在極顯著差異（P<001），而其在其他組織中的表達量均無顯著差異（P>005），初步推測其參與卵泡期大腦神經元細胞的生長增殖，從而調控性腺軸中下丘腦以及垂體活性，以此參與小尾寒羊卵泡期與黃體期的轉換過程，該基因的具體作用機制值得進一步探究。

KDM3B是組蛋白賴氨酸去甲基酶（KDMs）中KDM3家族的重要成員[9]。組蛋白賴氨酸去甲基酶（KDM）首次在哺乳動物中被發現，能去除組蛋白底物上的甲基，并通過賴氨酸去甲基化的作用在細胞增殖中發揮作用[27]。目前已在多種腫瘤相關的疾病中發現KDM3B的調控作用，如前列腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌[28-31]，這些結果表明KDM3B在細胞周期調控中是一個關鍵的表觀遺傳因子。該試驗發現KDM3B基因在小尾寒羊性腺軸7種組織中均有表達，表明該基因可能與繁殖相關，且在黃體期下丘腦中的表達量顯著高于卵泡期，初步推測其通過促進下丘腦細胞GnRH的分泌來動態調節FSH和LH的含量，進而參與小尾寒羊卵泡期至黃體期的激素調控。

NPTX1屬于神經元正五聚體蛋白（neuronal pentraxins，NPTX/NPs），它是正五聚蛋白（pentraxins，PTX）的一個超家族成員。正五聚蛋白主要為促炎或抗炎細胞因子，NPTX1主要在大腦皮質、海馬、小腦中表達[32]，屬于以鈣依賴性方式與多種蛋白質相互作用的NPTX家族成員，在突觸可塑性中發揮一定的作用[33]。研究發現，NPTX1與KDM3B一樣都屬于表觀遺傳調控基因，并通過過表達抑制細胞的生長增殖、侵襲和血管生成，在許多癌癥中起到抑制作用[33-36]。該試驗中該基因在性腺軸7種組織中均有表達，小腦中表達最高且黃體期顯著高于卵泡期，與預期結果相一致，推測其通過調控小腦中樞神經元的活性對小尾寒羊的生殖活動起抑制作用，參與黃體期到卵泡期發情狀態的轉換。

PLCB3是由2個G蛋白α亞基（α-Q和α-11）以及G蛋白β和γ亞基激活的，在啟動受體介導的信號轉導中起重要作用[37]。磷脂酶（PLC）是一大類酶，能將磷脂水解成脂肪酸和其他親脂性物質，在炎癥、細胞生長、信號轉導、細胞死亡和維持細胞膜磷脂等過程中起重要作用[38]。研究發現，該基因在排卵期大小的卵泡細胞中高表達，具有激活LH/LHR信號的作用[39]，并在芬蘭綿羊中鑒定出該基因與產羔數相關[40]。該試驗中PLCB3基因在性腺軸7種組織中均檢測到表達，其在卵巢中的表達量最高且黃體期顯著高于卵泡期，與前人結果相符，推測其在小尾寒羊從黃體期向卵泡期的轉換過程中激活LH/LHR信號，促進小尾寒羊發情啟動的過程。

RAS超家族具有信號轉導調節功能，其信號通路在細胞增殖調控中起著關鍵作用[41]，RASD1是RAS超家族中編碼小GTP酶的30 ku的G蛋白成員[42]，可作為受體非依賴性的鳥嘌呤核苷酸交換因子發揮作用[43]。在視交叉上核（SCN）中，RASD1在夜間表達較高水平的晝夜節律性，下丘腦中RASD1的表達則主要受到糖皮質激素以及血漿滲透壓的影響[15，44]。研究發現，RASD1是垂體前葉細胞中雌激素反應的即刻早期基因，調控垂體雌激素反應晚期基因的表達[14]。該試驗中RASD1基因在卵泡期垂體組織中表達量最多，與預期結果相一致，說明該基因在垂體水平經由雌激素的調控發揮局部作用，且黃體期大腦、小腦、子宮中的表達量均顯著大于卵泡期，推測其在黃體期受到黃體分泌雌激素的影響，然后通過參與垂體GnRH神經元的激活，從而誘導小尾寒羊卵泡期的啟動，調控小尾寒羊繁殖活動。

該試驗利用實時熒光定量PCR探究了ATF4、CCNG1、KDM3B、NPTX1、PLCB3和RASD1在卵泡期和黃體期的小尾寒羊性腺軸7種組織中的表達量差異，結果表明ATF4、CCNG1、KDM3B、NPTX1、PLCB3和RASD1基因在卵泡期、黃體期性腺軸相關組織中的表達有較大差異，表明這6個基因可能對綿羊繁殖力具有一定的調控作用，可為進一步闡明綿羊高繁殖力的分子機理提供參考。

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