動物醫學制藥專業中蛋白純化教學改革探索

張二芹 潘佳佳 陳紅英 張同旭

摘要 生物制品的質量關系到人類和動物的健康，而蛋白純化是生物制品的質量保證，因此通過課堂教學、實驗操作和考核方式，學生掌握蛋白純化的基本策略和方法，其目的讓學生做到學以致用，為研發單位和企業培養一批應用型人才。

關鍵詞 動物醫學制藥專業;生物制品;蛋白純化;教學方法

中圖分類號 S-01?? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）21-0277-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.21.072

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Exploration of Protein Purification Teaching Reform in Animal Medicine and Pharmaceutical Specialty

ZHANG Er-qin， PAN Jia-jia， CHEN Hong-ying et al

（College of Veterinary Medicine， Henan Agricultural University， National Animal Immunology International Joint Research Center， Zhengzhou， Henan 450046）

Abstract The quality of biological products is related to human and animal health， and protein purification is the quality guarantee of biological products.Therefore， students can master the basic strategies and methods of protein purification? through classroom teaching， experimental operations and assessment methods， the purpose of which is to enable students to apply what they have learned and cultivate a batch of application-oriented talents for research and development units and enterprises.

Key words Animal medicine and pharmaceutical specialty;Biological products;Protein purification;Teaching methods

基金項目 轉基因生物新品種培育重大專項（2016ZX08001006-010）。

作者簡介 張二芹（1976—），女，河南焦作人，副教授，博士，從事動物免疫研究。

收稿日期 2021-03-29

生物制品在預防和治療人類和動物傳染病方面作出了巨大的貢獻，如流感疫苗、豬瘟血清、流感HA重組蛋白、細胞因子IL-2和IFN（干擾素）、蛋白酶、犬瘟熱單克隆抗體、DNA重組產品、體外免疫診斷制品等[1]。然而這些生物制品大多數是從生物材料中提取或者通過表達系統（真核或原核）獲得的，除了目的蛋白外，還包括許多生物材料和表達系統（包括培養基）雜蛋白，其中有些雜蛋白對人和動物產生不良反應（如過敏反應）[2]，并且影響目的蛋白的活性和使用劑量，因此為了獲得具有高度安全、高效、易保存和低成本工廠化生產等特點的生物制品，必須對生物制品進行純化，使生物制品活性、安全以及純度達到臨床應用級別。

蛋白純化工藝是生物制品加工的下游環節，也是生物制藥企業最重要的生產環節。所以，為了獲得更優質的生物產品、為了適應當前生物制品發展的需要，為生物制藥企業和相關科研院所培養高質量的學生，該研究從教學內容、教學實訓和教學方法等[3]方面進行生物制品教學以及加強學生對生物制品的后期純化的工藝教學和實驗的培養等方面探索進行總結。

1 蛋白純化工藝教學實驗改革必要性

隨著自然環境和社會環境的改變，人類和動物的新老舊病不斷的出現，如2018年以來非洲豬瘟[4]、2019—2020年全球新冠肺炎[5]、2020年美國暴發的乙型H1N1流感[6]，以及世界各地暴發的禽流感H5N1、H5N6和H5N8等[7]重大傳染病。這些傳染病對人類和動物造成極大的危害，因此亟需對這些重大傳染病及時采取防控和治療措施，研發診斷試劑盒、制備疫苗和單克隆抗體等。生物技術的發展，疫苗、抗體和細胞因子等生物制品研究時間大大地縮短，隨之也在不斷地更新換代，但對蛋白質量和純度也要求越來越高。為了在短時間內獲得高純度的生物制品，為了讓制藥學生適應新形勢的發展需求，為社會培養應用型人才，因此對河南農業大學動物醫學制藥專業學生的抗原分離與純化教學提出了新的要求，并且要精選蛋白純化工藝教學改革內容。

2 蛋白純化工藝教學改革的主要內容

蛋白質純化技術和方法的發展已經成為許多生物技術進步的必要先決條件，所以為了激發本科生學習蛋白純化的濃厚興趣，蛋白純化內容從幾個方面進行改革。

2.1 蛋白純化的重要性

從生物材料中分離蛋白或者利用基因工程方法獲得蛋白，研究其結構與功能，了解生命活動的規律、各種生物相互之間關系，制備重大傳染病的疫苗、研發抗體及抗病毒藥物等具有重要的科學意義。2019年Wang等[8]解析了非洲豬瘟（ASFV）晶體結構，2020年Yao等[9]解析了新冠肺炎病毒（COVID-19）的晶體結構，這為今后研究蛋白的功能、制備疫苗及篩選抗體奠定基礎;在生物研究領域，應用酶如蛋白酶、RNA酶、DNA酶和連接酶等為實驗的順利進行提供了有力保障;食品、發酵、紡織、制革等工業需要活性酶，為人們的生活提供方便;在醫療方面，干擾素、細胞因子IL-2、單抗以及基因工程苗等為人類和動物的健康作出了重大貢獻。通過給學生介紹蛋白純化技術在病毒、各種酶以及生物藥品等領域應用，讓學生認識到純化蛋白的重要性，引導學生學習純化蛋白的興趣。

2.2 蛋白純化的策略及原則

為了讓學生盡快掌握蛋白純化方法，首先了解蛋白純化策略和原則[10]：制備的生物產品用途;原材料的選擇;處理原材料的條件;根據應用確定產品的純度;除去對人或動物有害物質和過敏原以及依據需求，確定產品的純化規模等。使學生在上課期間，帶著問題認真聽講，加深對純化知識的理解。同時在準備純化的過程當中，要讓學生明白純化的蛋白純度、生物活性和數量;掌握目標蛋白和關鍵雜質的性質，簡化技術選擇和優化;提前準備快速檢測蛋白活性/回收率和臨界污染物的方法;減少每個階段的樣品處理時間，保持抗原活性;減少添加物;盡早除去有害物質（生物材料中的蛋白酶，可能降解目的蛋白）;依據層析技術的特性，進行組合，除去雜質;減少純化步數，提高產品的回收率，縮短純化時間。循循善誘的方式引發學生學習的積極性。

2.3 緩沖液對蛋白結構和活性的影響

蛋白質氨基酸殘基的化學完整性（如Asn去酰胺化和Met氧化）和蛋白質高級結構的維持都高度依賴于溶液的pH。因此用緩沖試劑來控制pH和優化蛋白質穩定性，常用緩沖液包括三羥甲基氨基甲烷、磷酸鹽、醋酸、檸檬酸和甘氨酸液等，pH為3～10。在已知的溶液pH下，不同的緩沖離子會對蛋白質的化學穩定性和構象穩定性產生特定的離子效應，在自然界中既有穩定作用，也有破壞作用。例如，不同的緩沖溶液會影響干擾素和粒細胞集落刺激因子的物理化學穩定性。如檸檬酸多價羧酸緩沖液可以影響溶解度，并導致單抗在高蛋白濃度下形成凝膠，眾所周知，Tris（三羥甲基氨基甲烷）和磷酸鹽溶液的pH會分別隨溫度或冷凍而改變。鹽影響蛋白質構象的完整性和穩定性[11]。舉例說明緩沖試劑對蛋白結構和活性的影響，促使學生鞏固學過的專業理論知識，主動參與蛋白純化方案制作，練習DoE（Design of Experiment）試驗設計，在今后的實驗中能認真分析、思考，提高解決問題的能力。

2.4 填料對蛋白純化的影響

蛋白色譜層析是將目的蛋白從復雜的蛋白溶液中分離出來。常用的色譜層析包括離子交換層析、疏水層析、親和層析、凝膠過濾層析和反相層析（表1）。離子交換層析根據蛋白表面凈電荷的不同進行分離蛋白;疏水層析和反向層析都是依據蛋白的疏水性的不同分離蛋白，只是反向層析填料的表面通常比疏水填料更加疏水;親和層析是以一個蛋白與特異性配基配對到色譜填料上，并且與配基具有可逆性的相互作用，如抗原和抗體;凝膠過濾層析也稱為分子篩，根據蛋白分子量的大小分離蛋白。每種填料依據顆粒大小和分辨率又分為許多種類，以Q陰離子填料為例，填料顆粒越大，分標率越低，相反，填料顆粒越小，分辨率越高。生產這些填料的公司有中國的博格隆生物技術有限公司和納微科技有限公司，美國的GE公司和BIO-RAD公司，日本的TOSOH公司等。大多數純化方案都涉及多種形式的色譜層析法，因此色譜層析已經成為蛋白純化必要工具。不同的色譜層析技術具有不同的選擇性，可以形成強大的組合用于任何生物分子的純化，以最大限度地提高產量和減少所需的步驟。學生根據蛋白純化需要組合不同的色譜層析，才能達到自己想要的蛋白純度。理想情況下，蛋白純化過程[10]包括樣品制備、萃取和澄清（透析過濾和超濾）以及蛋白純化的3個環節，即蛋白捕獲、中間純化和精細純化（圖1）。在捕獲階段，分離、集中和穩定目標產品;在中間純化階段，去除大部分的雜質，如其他蛋白質、核酸、內毒素和病毒;在精細純化階段，去除任何剩余的痕量雜質或密切相關的物質來達到高純度。因此讓學生掌握每個環節目的不同，除掉的雜物也不相同，只有3個環節的填料最佳組合，才是保證快速方法開發以及較短時間獲得純產品的關鍵。

3 教學實訓

獸醫生物制品學是一門應用性學科，學生須將課本上學的純化理論知識與生產實踐結合起來，才能更好地融會貫通。所以課堂實驗操作[12-13]練習之前，回顧蛋白純化目的和意義、純化策略以及蛋白純化遵循原則，如建立蛋白純化快速的檢測方法、不同填料之間的如何搭配等。實驗課上給定已知蛋白，讓學生學會使用分子生物學軟件，分析蛋白的性質，自己設計試驗，挑選緩沖液和試劑，裝填料柱，進行手動操作練習蛋白純化，初步掌握蛋白純化流程;其次教師組織學生到科研單位（動物免疫學重點實驗室）觀看蛋白純化自動化儀器操作過程，認識純化儀器AKTA、過濾儀器以及離心機等儀器，學會使用儀器，帶著問題進行仔細觀察教師和博士生純化蛋白的整個流程，加深認知蛋白純化工藝;最后帶領學生參觀生物制品制造企業，了解生物制品規模化生產，實地觀察蛋白純化工藝放大過程，逐步地從課堂理論知識過渡到實驗室基本操作過程以及進一步了解蛋白純化自動化操作流程，讓學生更深一步掌握蛋白純化一系列工藝流程，真正做到學以致用，為研發單位和企業培養一批批應用型人才。

4 教學手段與方法

4.1 課堂教學

通過上課講解，首先讓學生獲得大量的純化蛋白知識理論，及時進行提問，與學生進行互動，把理論知識掌握的更牢固，充分提高教學效率。其次教師每天要查閱大量的新知識，及時給學生補充新內容。課堂上列舉生活中經常應用的藥物或者蛋白，例如流感HA蛋白、豬瘟E2蛋白

和白蛋白等，講解這些蛋白的純化過程，激發學生學習的興趣和熱情。同時借助多媒體教學，添加一些圖片、動畫以及蛋白純化視頻，豐富教學內容，吸引學生的注意力，學生發現問題，課堂當場解決，提高學生積極主動學習的樂趣[14-15]。

4.2 網絡教學

2020年受新冠肺炎的影響，大中小學生不能走進教室進行正常上課，為了不耽誤學生學習的進程，國家主張“停課不停學”政策，所以在特殊時期，網絡教學[16-18]成為另一種教學方式。在網上開課之前，教師們紛紛響應國家的號召，錄制網絡視頻，或者通過超星、金課建設、釘釘和騰訊視頻直播給同學們上課。學生能在上課時間準時聽課和學習，通過視頻與教師們進行互動交流、討論問題，也可以下載課件回放多次聽課，彌補課堂中的不足，起到了加深理解、解惑問題的作用。同時教師在網絡上布置作業，再次鞏固當天學習的知識。為了讓學生充分利用現代化信息技術，教師給學生介紹一些生物制品相關的網站如生物谷和中國生物技術網，學生利用課余時間瀏覽網站，可以查看各種期刊發布的新內容、新技術和新方法，如新冠、非洲豬瘟和流感疫苗等的不同制備方法、免疫保護效果，調動學生主動學習新知識、新內容的積極性。

4.3 學生考核方式

為了讓學生在短時間內掌握抗原純化方法，提高學生的分析能力、動手能力以及主動解決問題的能力，對學生的實驗技能按照百分制進行考核，例如純化水稻中的新城疫F蛋白[19]，進行百分制考核[20]（表2）。總之對學生進行多方面考核，既鍛煉學生的思考、動手以及解決問題的能力又體現了學生們團結合作精神。

5 總結

生物藥物的品質關系到人類和動物安全，蛋白的純度決定生物品質，這充分說明蛋白純化的重要性，因此嘗試著通過教學內容、教學實訓以及教學方法改革蛋白純化的內容，讓學生掌握蛋白純化的意義、純化蛋白遵循的原則以及不同填料的組合和應用，使得學生在蛋白純化技術方面得到全面的鍛煉，也為制藥專業學生今后發展和就業奠定了基礎。

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