微型月季抗逆性基因表達(dá)與微衛(wèi)星序列連鎖分析

王建婷 劉廣達(dá) 吳歸 安天琪 李娜

摘要 使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法研究水楊酸和茉莉酸甲酯處理微型月季的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)2種處理的植物-病原菌相互關(guān)系通路均有數(shù)量較多的差異表達(dá)基因，并對(duì)該通路中差異表達(dá)基因連鎖的微衛(wèi)星序列進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。該研究有助于進(jìn)一步理解水楊酸和茉莉酸甲酯提升微型月季抗逆性的機(jī)理。篩選與抗逆基因連鎖的微衛(wèi)星序列可為今后的育種研究提供幫助。

關(guān)鍵詞 微型月季;微衛(wèi)星序列;水楊酸;茉莉酸甲酯

中圖分類號(hào) S 943.2? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2021）21-0124-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.21.030

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Expression of Stress Resistance Genes and Linkage Analysis of Microsatellite Sequences in Miniature Rose

WANG Jian-ting， LIU Guang-da， WU Gui et al

（ School of Pharmacy， Baotou Medical College， Inner Mongolia University of Science Technology， Baotou， Inner Mongolia 014040）

Abstract In this study， we used transcriptomics methods to study the gene expression of miniature rose treated with salicylic acid and methyl jasmonate， it was found that there were a number of differentially expressed genes in the plant-pathogen interaction pathway after the two treatments， and the microsatellite sequences linked to the differentially expressed genes in the pathway were statistically analyzed. This study will help to further understand the mechanism of salicylic acid and methyl jasmonate improving the stress resistance of miniature rose. Screening microsatellite sequences linked to stress resistance genes will provide help for future breeding research.

Key words Miniature rose;Microsatellite sequences;Salicylic acid;Methyl jasmonate

基金項(xiàng)目? 自治區(qū)級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201910127017）。

作者簡(jiǎn)介 王建婷（1998—），女，四川宜賓人，從事藥用植物研究。*通信作者，講師，博士，從事藥用植物生物技術(shù)研究。

收稿日期 2021-05-27

微型月季（Rosa hybrid minima）為薔薇科植物，由于具有花色奇異、全年開放和適于盆栽等特點(diǎn)[1]，深受消費(fèi)者喜愛，具有較高的市場(chǎng)價(jià)值。生物和非生物脅迫是微型月季生產(chǎn)中的重要問(wèn)題。在栽培過(guò)程中，微型月季會(huì)受到多種病原微生物的生物脅迫[2]。在運(yùn)輸過(guò)程中，微型月季易受到黑暗、缺水和震動(dòng)等非生物脅迫[3]。提升微型月季的抗逆性對(duì)其商品化生產(chǎn)有著重要作用。水楊酸和茉莉酸甲酯是植物體內(nèi)普遍存在的抗性信號(hào)分子，可以對(duì)生物和非生物脅迫產(chǎn)生響應(yīng)，提升植物的抗性[4-6]。外施水楊酸和茉莉酸甲酯可以促進(jìn)多種植物抗逆性[7]。

微衛(wèi)星序列又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR），是存在于大部分真核生物基因組中的短串重復(fù)序列[8]，SSR分子標(biāo)記技術(shù)在植物育種和近緣植物親緣關(guān)系研究方面有著廣泛的應(yīng)用[9]。隨著轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的發(fā)展，許多植物開展了針對(duì)轉(zhuǎn)錄組中SSR的研究[10-11]。相比于基因組中的SSR，轉(zhuǎn)錄組中的SSR存在于發(fā)生轉(zhuǎn)錄的基因序列中，這些SSR可能與功能基因直接相關(guān)，從而與性狀有更好的相關(guān)性[12-13]。

該研究以水楊酸和茉莉酸甲酯處理微型月季，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法研究處理后差異表達(dá)基因富集程度較高的代謝通路，分析與抗逆性相關(guān)的代謝通路，探討外施水楊酸和茉莉酸甲酯對(duì)微型月季抗逆性作用機(jī)制的差異，尋找與主要抗逆性代謝通路中基因相連鎖的SSR序列，為提升微型月季抗逆性的育種工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇盆栽微型月季（Rosa hybrid minima），采取葉面噴施的方法，水楊酸處理噴施100 mL 1 mmol/L水楊酸，茉莉酸甲酯處理噴施100 mL 1 mmol/L茉莉酸甲酯，對(duì)照噴施100 mL蒸餾水（CK）。處理24 h后，采集微型月季的花瓣。

1.2 方法

采集花瓣后液氮速凍，使用Invitrogen Trizol試劑提取總RNA，經(jīng)質(zhì)檢后送聯(lián)川生物進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建和高通量測(cè)序，測(cè)序采用Illumina Hiseq 4000平臺(tái)，測(cè)序讀長(zhǎng)為雙端2×150 bp。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測(cè)序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)（raw data）去除接頭序列，過(guò)濾掉不合格序列后得到有效數(shù)據(jù)（clean data）。采取混合組裝的策略，歸一化得到Unigene，使用DIAMOND軟件[14]對(duì)組裝的Unigenes進(jìn)行注釋。使用Salmon軟件[15]計(jì)算Unigenes的表達(dá)水平，使用R軟件包edge R篩選差異表達(dá)Unigenes[16]，使用perl腳本進(jìn)行KEGG富集分析，設(shè)置差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)為│log2（fold change）│>1（P≤0.05）。富集因子（rich factor）為位于該KEGG通路的差異基因數(shù)/位于該KEGG通路的總基因數(shù)。對(duì)顯著差異的基因占某個(gè)通路所有基因數(shù)的比例和所有通路的總基因數(shù)目中的差異基因比例進(jìn)行檢驗(yàn)，得出富集分析中通路的P值。SSR的鑒定使用MISA軟件（http：∥pgrc.ikp-gatersleben.de/misa/）對(duì)Unigenes進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水楊酸對(duì)微型月季基因轉(zhuǎn)錄的影響

水楊酸處理組與CK相比，在差異表達(dá)基因富集程度最高的20條KEGG代謝通路中，異黃酮生物合成通路（isoflavonoid biosynthesis）的富集因子值最大，為0.3 差異表達(dá)Unigene基因數(shù)為8，通路的P值為3.9×10-4。植物-病原菌相互關(guān)系（plant-pathogen interaction）通路差異表達(dá)Unigene基因數(shù)最多，為13 富集因子為0.10，通路的P值為1.4×10-3（圖1）。

2.2 茉莉酸甲酯對(duì)微型月季基因轉(zhuǎn)錄的影響

茉莉酸甲酯處理組與對(duì)照相比，在差異表達(dá)基因富集程度最高的20條代謝通路中，異黃酮生物合成（isoflavonoid biosynthesis）通路的富集因子值最大，為0.3 差異表達(dá)Unigene基因數(shù)為8，通路的P值為2.2×10-6。植物-病原菌相互關(guān)系（plant-pathogen interaction）通路差異表達(dá)Unigene基因的數(shù)量最多，為8 富集因子為0.06，通路的P值為9.2×10-6（圖2）。

2.3 抗逆性相關(guān)代謝通路基因表達(dá)分析

將差異表達(dá)的Unigene在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行注釋，水楊酸處理注釋到27個(gè)KO條目中，注釋到108個(gè)基因（表1）。茉莉酸甲酯處理注釋到24個(gè)KO條目中，注釋到64個(gè)基因（表2），其中有3個(gè)KO條目未注釋到基因。

2.4 植物-病原菌相互關(guān)系通路差異表達(dá)基因與微衛(wèi)星序列連鎖分析

與CK相比，水楊酸處理和茉莉酸甲酯處理后植物-病原菌相互關(guān)系通路中顯著差異表達(dá)的基因數(shù)均為最多，且與抗逆性有著緊密的聯(lián)系，有利于發(fā)掘抗逆性相關(guān)的SSR。設(shè)置連鎖的條件為KEGG注釋基因與SSR存在于同一Unigene中，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并記錄基因名與具體SSR序列（表3）。水楊酸處理與CK相比，植物-病原菌相互關(guān)系通路中有134個(gè)Unigene數(shù)量差異顯著，注釋到108個(gè)基因，其中有26個(gè)基因與SSR序列連鎖。茉莉酸甲酯處理與CK相比，植物-病原菌相互關(guān)系通路中有82個(gè)Unigene數(shù)量差異顯著，注釋到64個(gè)基因，其中有15個(gè)基因與SSR序列連鎖。WRKY24、NQR、DREB3和PBL5 4個(gè)基因在水楊酸和茉莉酸甲酯處理下均與SSR存在連鎖關(guān)系。WRKY65、MYB108、PDPK2、WNK5、At2g26730、CRCK2、WRKY53、WRKY48和WRKY24基因與2個(gè)SSR連鎖。WRKY22基因與3個(gè)SSR連鎖。

3 討論

在植物應(yīng)對(duì)生物脅迫時(shí)，植物體內(nèi)水楊酸、茉莉酸和乙烯通過(guò)影響各種信號(hào)通路相互作用提升抗性;而在應(yīng)對(duì)非生物脅迫時(shí)，脫落酸調(diào)節(jié)的信號(hào)通路起到重要作用。在提升植物抗逆性過(guò)程中，這2類信號(hào)通路間有著復(fù)雜的相互影響，整體上處于拮抗關(guān)系[17]。異黃酮類物質(zhì)有助于提升植物的生物抗性，如大豆異黃酮可以抵抗植物病原微生物和食草性昆蟲，誘導(dǎo)根瘤菌結(jié)瘤以利于植物抵御逆境[18]。在該試驗(yàn)中，水楊酸和茉莉酸甲酯處理后，異黃酮生物合成通路的富集因子值均為最大，異黃酮生物合成通路中的基因差異表達(dá)可能有助于特定種類異黃酮的合成，從而提升植物的抗性。水楊酸處理后，與CK相比，植物-病原菌相互關(guān)系、淀粉和蔗糖代謝和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路差異表達(dá)基因數(shù)量較多。而茉莉酸甲酯處理后，僅植物-病原菌相互關(guān)系通路差異表達(dá)基因的數(shù)量較多，且2種處理后植物-病原菌相互關(guān)系通路的P值存在差異，說(shuō)明2種誘導(dǎo)子的作用機(jī)制存在差異。

水楊酸和茉莉酸甲酯均可以通過(guò)植物-病原菌相互關(guān)系通路提升植物抗性，尤其是提升抵抗病原菌的能力[19]，也可以產(chǎn)生系統(tǒng)性獲得抗性（systemic acquired resistance，SAR）。

SAR可以長(zhǎng)效提升植物抗性和緩解植物受到的非生物脅迫[ 17，20]。在該研究中，與CK相比，水楊酸處理組和茉莉酸甲酯處理組中植物-病原菌相互關(guān)系通路中顯著差異表達(dá)的基因數(shù)均為最多，說(shuō)明該通路對(duì)微型月季的抗逆性有著重要作用。在差異表達(dá)基因與微衛(wèi)星序列連鎖分析中，有一定數(shù)量的SSR與植物-病原菌相互關(guān)系通路中的差異表達(dá)基因相連鎖，為開發(fā)抗逆性相關(guān)代謝通路的分子標(biāo)記提供了豐富的信息位點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1] 馮歡，易姝利，謝佳恒，等.微型月季愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生[J].植物學(xué)報(bào)，201 49（5）：595-602.

[2] 竇坦德，劉和風(fēng).出口盆栽微型月季的病蟲害控制及檢疫技術(shù)研究[J].檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2006，16（S1）：55-58.

[3] MLLER R，SISLER E C，SEREK M.Stress induced ethylene production，ethylene binding，and the response to the ethylene action inhibitor 1-MCP in miniature roses[J].Scientia horticulturae，2000，83（1）：51-59.

[4] HALIM V A，VESS A，SCHEEL D，et al.The role of salicylic acid and jasmonic acid in pathogen defence[J].Plant biology，2006，8（3）：307-313.

[5] HORVTH E，SZALAI G，JANDA T.Induction of abiotic stress tolerance by salicylic acid signaling[J].Journal of plant growth regulation，2007，26（3）：290-300.

[6] 嚴(yán)俊鑫，遲德富，張永強(qiáng)，等.JA、SA對(duì)重瓣玫瑰生長(zhǎng)發(fā)育和防御酶活性的影響[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，201 35（3）：128-136.

[7] 包穎，魏琳燕，陳超.水楊酸和茉莉酸甲酯對(duì)鹽脅迫下月季品種月月粉生理特性的影響[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)），2020，35（6）：1040-1045.

[8] POWELL W，MACHRAY G C，PROVAN J.Polymorphism revealed by simple sequence repeats[J].Trends in plant science，1996，1（7）：215-222.

[9] 楊夢(mèng)婷，黃洲，干建平，等.SSR分子標(biāo)記的研究進(jìn)展[J].杭州師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2019，18（4）：429-436.

[10] 杜曉華，楊雅萍，朱小佩，等.三色堇轉(zhuǎn)錄組SSR分析及分子標(biāo)記開發(fā)[J].園藝學(xué)報(bào)，2019，46（4）：797-806.

[11] 王榮香，徐子健，于平，等.海南粗榧轉(zhuǎn)錄組SSR特征分析[J].分子植物育種，2019，17（6）：1951-1957.

[12] EUJAYL I，SORRELLS M E，BAUM M，et al.Isolation of EST-derived microsatellite markers for genotyping the A and B genomes of wheat[J].Theoretical and applied genetics，200 104（2/3）：399-407.

[13] WANG H Y，WEI Y M，YAN Z H，et al.EST-SSR DNA polymorphism in durum wheat（Triticum durum L.）collections[J].Journal of applied genetics，2007，48（1）：35-42.

[14] BUCHFINK B，XIE C，HUSON D H.Fast and sensitive protein alignment using DIAMOND[J].Nature methods，2015，12（1）：59-60.

[15] PATRO R，DUGGAL G，LOVE M I，et al.Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression[J].Nature methods，2017，14（4）：417-419.

[16] ROBINSON M D，MCCARTHY D J，SMYTH G K.edgeR：a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data[J].Bioinformatics，2010，26（1）：139-140.

[17] YASUDA M，ISHIKAWA A，JIKUMARU Y，et al.Antagonistic interaction between systemic acquired resistance and the abscisic acid-mediated abiotic stress response in Arabidopsis[J].Plant cell，2008，20（6）：1678-1692.

[18] 周三，周明，張碩，等.鹽生野大豆的異黃酮積累及其生態(tài)學(xué)意義[J].植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，31（5）：930-936.

[19] 嚴(yán)俊鑫，遲德富，張永強(qiáng)，等.水楊酸誘導(dǎo)重瓣玫瑰對(duì)白粉病的抗性[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，201 41（8）：95-101.

[20] BISWAS C，DEY P，KARMAKAR P G，et al.Next-generation sequencing and micro RNAs analysis reveal SA/MeJA1/ABA pathway genes mediated systemic acquired resistance（SAR）and its master regulation via production of phased，trans-acting siRNAs against stem rot pathogen Macrophomina phaseolina in a RIL population of jute（Corchorus capsularis）[J].Physiological and molecular plant pathology，201 87：76-85.