固相萃取-高效液相色譜法測定地表水中苯胺類

劉 暢

(遼寧省生態環境監測中心，遼寧 沈陽 110161)

1 引言

苯胺類化合物是重要的工業原料，具有致癌、致畸、致突變性，可通過呼吸道、消化道進入人體，亦可經皮膚吸收。我國環境優先污染物黑名單已將苯胺、二硝基苯胺、對硝基苯胺、2,6-二硝基苯胺等列入其中。在我國的標準體系中，《地表水環境質量標準》(GB 3838-2002)中關于生活飲用水地表水源中苯胺的限值為100 μg/L。由于苯胺類化合物很難被生物降解，易在環境中造成累積污染，因此，為了有效掌握并控制地表水體中苯胺類的污染狀況、確保公眾用水安全，開發地表水中簡單實用且靈敏度較高的檢測方法具有重要意義[1]。

本研究建立了經樣品前處理，可同時檢測生活飲用水及其水源水中苯胺、對硝基苯胺、2,4-二硝基苯胺、3,5-二硝基苯胺、2,6-二氯-4-硝基苯胺5種苯胺類化合物的固相萃取-高效液相色譜檢測方法，實現苯胺類化合物較為快速、簡便的分析。

2 材料與方法

2.1 適用范圍

本方法規定了測定地表水中5種苯胺類化合物的固相萃取-高效液相色譜法。

本方法適用于生活飲用水及其水源水中苯胺、對硝基苯胺、2,4-二硝基苯胺、3,5-二硝基苯胺、2,6-二氯-4-硝基苯胺的測定。

本方法檢出限為：苯胺類0.5 μg/L。

2.2 原理

樣品經過濾后，通過固相萃取技術富集水樣中苯胺類，洗脫液濃縮定容后，用高效液相色譜儀(二極管陣列檢測器)進行分離檢測。固相萃取是一種物理萃取過程，包括液相和固相，固相對苯胺類化合物的吸附力大于樣品母液；當樣品通過固相萃取柱時，苯胺類被吸附在固體表面，其他組分則隨樣品母液通過固相萃取柱；最后用洗脫液將苯胺類洗脫下來，用高效液相色譜儀檢測分析，根據保留時間和特征吸收譜圖定性，外標法定量。

2.3 試劑及藥品

樣品分析、標準樣品配置所使用的試劑除均為色譜純或優級純(有特殊規定的除外)。

甲醇：每批甲醇都要進行空白檢驗，液相色譜純；去離子水：超純水儀制備，滿足電阻率≥18.2 MΩ/cm，TOC<5 μg/L，不含目標化合物；苯胺類標準儲備液及使用液：苯胺類標準儲備液100mg/L，可直接購買有證標準溶液，按照產品說明書要求保存，也可用標準物質配置，標準物質純度要大于99.0%，用甲醇作溶劑，-10 ℃及以下冷凍、避光保存；苯胺類標準使用液1.00 mg/L，取適量儲備液，甲醇作溶劑進行稀釋，-10 ℃及以下冷凍、避光保存，保質期一個月；固相萃取柱：MCX固相萃取柱(500 mg，6 mL)或其他等效固相萃取柱；濾膜：0.45 μm聚四氟乙烯濾膜；硫代硫酸鈉：優級純；鹽酸：1.19 g/mL，優級純；甲酸：液相色譜純；氨水：0.91 g/mL，優級純；氮氣：純度≥99.99%。

2.4 儀器設備、器皿

高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器；色譜柱：HSS T3 液相色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)或等效色譜柱；固相萃取儀：自動或手動(帶真空泵)，流速可調；自動濃縮儀：氮吹濃縮儀或其他性能相當的設備；各種規格的微量注射器或移液器。

2.5 樣品的采集、保存

將水樣采集于棕色的磨口玻璃瓶中，樣品瓶要確保充滿、無氣泡，不留空隙。完成樣品采集后，用氨水和甲酸將樣品pH值調節至7～8之間，同時，加入硫代硫酸鈉(加入量：40 mg/500 mL)。水樣中的苯胺類易于降解，需在4 ℃及以下冷藏且避光條件下保存，盡快分析。采樣后應在24h內進行萃取，且萃取后需在7 d內進行分析[2]。

2.6 分析步驟

2.6.1 前處理

取水樣1000 mL，經0.45 μm濾膜減壓過濾，濾液過MCX固相萃取柱。固相萃取柱使用之前以10 mL甲醇和10 mL去離子水進行活化。控制水樣以5～10 mL/min的流速通過固相萃取柱，從而進行富集濃縮。上樣過程完成后，分別用10 mL 0.1 mol/L 鹽酸和10%甲醇水溶液清洗以凈化樣品，用氮氣吹干固相萃取柱后，用10 mL 2%氨水甲醇溶液以1 mL/min的流速將固相萃取柱中的組分洗脫下來，洗脫液收集于濃縮瓶內，氮吹濃縮至1.0 mL以下，用20%甲醇水溶液定容至1.0 mL，并經針頭過濾器過濾，保存待測定[3]。

2.6.2 空白樣品

空白樣品實驗過程即用實驗室用去離子水代替實際樣品，嚴格按照2.6.1節規定的步驟進行空白樣品制備。

2.6.3 液相色譜分析條件(推薦)

色譜柱：HSS T3液相色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)。 流動相：梯度洗脫；V甲醇∶V水(含0.2%乙酸)=35∶65(V/V)，保持15 min，后以線性變化至甲醇∶水=60∶40(V/V)，并保持15 min。 檢測器：配有二極管陣列檢測器(掃描范圍：200～400 nm)，定量波長254 nm或230 nm。 進樣體積：10 μL。 流 速：0.8 mL/min。 色譜柱溫：30 ℃。 依據保留時間和檢測物質特征吸收譜圖進行定性分析，使用外標法峰面積進行定量計算。

2.6.4 標準曲線的繪制

取100 mg/L苯胺類標準儲備溶液用甲醇稀釋至6個質量濃度(至少5個質量濃度)：1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L和50.0 mg/L。在推薦的液相色譜分析條件下，對系列標準溶液進行測定，由低濃度到高濃度依次進樣，以苯胺類含量(mg/L)對峰面積(μV·s)繪制標準曲線，回歸方程線性良好，相關系數為0.999。

2.6.5 樣品的測定

在推薦的液相色譜分析條件下，按照2.6.4節中的要求進行樣品的測定。

2.6.6 空白樣品的測定

在推薦的液相色譜分析條件下，按照2.6.5節中的要求進行空白樣品的測定。

2.7 精密度和準確度

分別取質量濃度為1.0 mg/L和10.0 mg/L的苯胺類溶液進行6次平行測定，其相對標準偏差為2.4%～8.1%。添加以上濃度水平的水樣進行回收率實驗，回收率為72.2%～96.1%。

3 質量保證和質量控制

3.1 空白樣品的測定

每批次(≤20個樣品/批)或每20個樣品至少應進行一個實驗室空白樣品的測定，空白樣品的測定結果應低于方法的檢出限。

3.2 平行樣品

每批次(≤20個樣品/批)或每20個樣品至少應進行一個平行樣品的測定，平行樣品測定結果的相對偏差應控制在25%以內。

3.3 校準

要針對每批樣品建立標準曲線，標準曲線的相關系數應≥0.995。每批次(≤20個樣品/批)或每20個樣品應對標準曲線中間濃度點標準溶液進行一次測定，中間濃度點標準溶液的測定結果與該點濃度相對誤差需控制在±20%之內。

4 結果與討論

4.1 色譜柱的選擇

苯胺類化合物一般采用C18柱分析。通過實驗對比C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)和HSS T3柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)對目標化合物的分離效果，結果表明：C18柱對2,4-二硝基苯胺、3,5-二硝基苯胺未能實現完全分離，而HSS T3柱對5種苯胺類化合物均實現了較好分離[4]。

4.2 流動相的優化

通過實驗對比等度淋洗和梯度淋洗對目標化合物的分離效果，為了達到5種苯胺類化合物均良好分離且整體出峰時間合理，需采用梯度淋洗方式。由于最先出峰的3種苯胺類化合物極性較為相近，需要采用低比例的有機相才能實現完全分離，若采用等度淋洗，則會導致后面兩種苯胺類化合物無法被洗脫。經多次實驗，V甲醇∶V水=35∶65(V/V)，保持15 min，后以線性變化至甲醇∶水=60∶40(V/V)，并保持15 min，可實現5種苯胺類化合物的良好分離[5]。

苯胺類化合物呈弱堿性，流動相若為甲醇-水，形成的色譜峰較寬，有拖尾現象。實驗通過在流動相的水相中分別添加0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%(V/V)的甲酸，使流動相呈酸性，抑制鍵合相表面的未烷基化硅醇羥基的電離趨勢，從而降低二次作用的強度，來考察流動相對目標化合物的分離效果。結果顯示，甲酸的加入，對峰形有顯著改善，隨著甲酸配比的增加，峰形隨之變尖銳，分離度同步提高。甲酸濃度提高至0.02%(V/V)時，分離度改善顯著，因此選用水相中加入0.02%甲酸組成流動相[6]。

5 注意事項

(1)方法采用的固相萃取柱為MCX柱，此類固相萃取柱主要對弱堿性化合物有較好的萃取效果，若選用其他等效固相萃取柱，萃取柱的活化和洗脫等條件要做對應改變。

(2)樣品濃縮過程中，要控制好濃縮速度，不宜過快，切記不要吹干，以免造成苯胺類物質的大量損失。

(3)由于苯胺類物質的毒性較高，在樣品前處理、標準樣品配置等過程中應佩戴防護器具，在通風櫥中操作，避免試劑和樣品接觸皮膚和衣物。

(4)實驗過程中產生的固體廢物務必嚴格做到統一收集、分類管控，委托有處理資質的機構定期轉運、處置。

6 干擾和消除

(1)當樣品受到基質干擾影響測定結果時，通過對樣品進行預處理、減少進樣體量(稀釋樣品或減少進樣體積)、優化實驗過程條件等方式減少或消除干擾。

(2)當樣品存在同分異構體干擾影響測定結果時，可通過優化高效液相色譜的梯度淋洗條件(淋洗液流速、柱溫箱溫度、淋洗液配比等)改善分離度，進而減少或消除干擾。

(3)當樣品受到余氯等氧化性較強的物質干擾影響測定結果時，可通過在樣品的采集、保存過程加入一定量的硫代硫酸鈉消除干擾。

7 結語

本文利用固相萃取-高效液相色譜開發了一種同時測定生活飲用水及其水源水中5種苯胺類化合物的檢測方法，方法在1.0 mg/L～50.0 mg/L范圍內線性良好，方法檢出限為苯胺類化合物0.5 μg/L，回收率為72.2%～96.1%。同時，嘗試對色譜柱進行優選并對流動相的配比和梯度淋洗程序進行改進，通過實驗發現，C18色譜柱對2,4-二硝基苯胺、3,5-二硝基苯胺未能完全分離，HSS T3柱對5種苯胺類化合物均實現了較好分離；綜合考慮苯胺類化合物的出峰間隔和試劑成本，對流動相的配比和梯度淋洗程序進行了優化，在流動相中加入0.02%甲酸，有效改善苯胺類化合物峰型及分離效果。改良后，方法操作簡單、靈敏度較高，具有較好的精密度和準確度，能很好地滿足生活飲用水及其水源中苯胺類化合物的日常檢測要求[7～10]。