胰腺癌組織中SMC1A表達的臨床意義及對細胞增殖的影響

許樂鵬，劉培慧，盛偉偉，王季堃

（1.錦州醫科大學附屬第一醫院腫瘤內科，遼寧 錦州 121001；2.葫蘆島市中心醫院腫瘤日間病房，遼寧 葫蘆島 125000；3.葫蘆島市中心醫院介入血管外科，遼寧 葫蘆島 125000；4.中國醫科大學附屬第一醫院胃腸疝外科，沈陽 110001）

研究［1］顯示，我國2000年至2011年男性胰腺癌 發病率及年齡-標準化死亡率顯著上升，分別為惡性腫瘤的第一位和第二位。胰腺癌死亡率高的主要原因為疾病早期檢出率低，而且發病后腫瘤細胞的轉移能力以及對周圍組織的侵襲能力強，進而預后極差。因此，提高疾病的早期檢出率，改善患者預后是目前急需解決的課題。

已有研究［2］發現染色體不穩定是惡性腫瘤的主要特征之一，其在惡性腫瘤發生進展中起著關鍵作用。在細胞對染色體穩定性進行維護的過程中，凝聚蛋白復合體是關鍵因子。染色體結構維持蛋白1A（structural maintenance of chromosomes protein 1A，SMC1A）是組成凝聚蛋白的主要亞基，其功能異常與惡性腫瘤（大腸癌、前列腺癌和肝癌）發生密切相關［3-5］。胰腺癌組織中SMC1A表達的臨床意義及對細胞增殖的影響尚未見報道。本研究旨在檢測胰腺癌組織中SMC1A表達情況，探討其表達的臨床意義及對胰腺癌細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2010年1月至2015年12月錦州醫科大學附屬第一醫院腫瘤內科行胰腺癌手術切除并經術后病理證實為腺癌的標本59例。納入標準：（1）臨床資料完整；（2）提供標本的患者可接受隨訪。胰腺癌細胞系，包括轉移性胰腺癌細胞［AsPC-1（轉移性腹水）、SW1990（脾轉移）］和原發胰腺癌細胞（BxPC-3和PANC-1）均購自中科院上海細胞庫，并用含10%胎牛血清1640培養液（美國HyClone公司）培養。主要試劑包括SMC1A單克隆抗體（美國Abcam公司），DAB顯色液、免疫組化試劑盒（北京中杉金橋公司），轉染試劑Opti-MEM及Oligofectamine2000（美國Invitrogen公司），ECL發光試劑盒、BCA定量蛋白裂解液及抑制劑（碧云天生物公司），SYBR Green Ⅱ 實時熒光定量PCR 試劑盒、逆轉錄試劑盒（DRR037S）、RNA分離試劑盒 TRIzol（日本TaKaRa公司）。SMC1A siRNA由上海吉瑪公司設計合成。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化：標本均經甲醛固定、4 μm切片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后去除內源性過氧化酶。PBS清洗后將胰腺癌組織標本置于pH 6.0檸檬酸高壓修復1 min，自然冷卻。室溫環境下封閉血清，再將一抗（1 ∶200）加入，更換至4 ℃環境下12 h孵育。第2天加入霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，PBS清洗、DAB顯色、蘇木素復燃。鹽酸乙醇分化后脫水、透明、封片后光學顯微鏡（400倍）下觀察。

1.2.2 SMC1A表達判定：參照文獻［6］，每張切片觀察5個視野，每個視野記數100個細胞。（1）陽性細胞數0～10%，0分；＞10%～25%，1分；＞25%～50%，2分；＞50%～75%，3分；＞75%，4分。（2）染色強度：無著色，0分；淺黃色，1分；黃或深黃色，2分；褐或棕褐色，3分。2項評分乘積＞4分為SMC1A高表達，≤4分為低表達。

1.2.3 Western blotting檢測：轉染SMC1A胰腺癌細胞系接種至6孔板，48 h后加入裂解液和蛋白酶抑制劑提取總蛋白，超聲裂解，冰上靜置 30 min 后12 000 r/min 4 ℃離心10 min，收集上清液，采用二辛可寧酸法測定蛋白濃度，經10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，80 V 100 min 電轉移至聚偏二氟乙烯膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入SMC1A（1 ∶1 000）4 ℃ 孵育過夜。二抗室溫孵育 2 h，凝膠顯像儀（以色列MF-chemibis 3.2 DNR公司）顯像。

1.2.4 實時定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）：采用 RNA分離試劑盒TRIzol提取并純化組織總RNA，所有RNA樣本濃度均稀釋至1 μg/μL，根據逆轉錄和擴增試劑盒說明書進行逆轉錄和擴增。熒光實時PCR反應體系 25 μL（2× SYBRR Premix ExTaqTM12.5 μL，100 nmol/ L上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，H2O 8.5 μL）。SMC1A上游引物5’-AAGTGAGGAGGAGGAGGAG-3’，下游引物5’-ACTTTCTTCAGGGTCTTGTTC-3’；GAPDH上游引物5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。反應條件：95 ℃ 5 min，保持5 s，60 ℃ 30 s，以此為1個循環，共循環45次，并配有復孔，焦碳酸二乙酯水為陰性對照。結果采用2-ΔΔCt計算。

1.2.5 SMC1A siRNA干擾實驗：將對數生長期Capan-2細胞加入6孔板，嚴格按照Oligofectamine2000說明進行瞬時轉染，取對數生長期Capan-2胰腺癌細胞加入6孔板中68 h，8 μL 脂質體與200 μL opti-MEM混合靜置5 min后與含8 μL siRNA（20 μmol/L）200 μL的opti-MEM混合靜置20 min，然后加入相應各孔中。6 h后換液，24～48 h后提取相應RNA、蛋白。

1.2.6 細胞增殖：酶標定量儀檢測SMC1A siRNA組（轉染SMC1A siRNA）和對照組（轉染空白對照）轉染1～5 d后的細胞，經MTT噻唑藍法（5 mg/mL）和二甲基亞砜（DMSO）處理后用酶標定量儀檢測波長570 nm處的吸光度（optical density，OD）值。細胞增殖率=（OD實驗組-OD調零孔）/（OD對照組-OD調零孔）×100%，實驗重復3次，取平均值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 胰腺癌組織中SMC1A的表達

結果顯示，癌組織中SMC1A主要在胞質和胞核中表達，59例胰腺癌組織中有37例（62.7%）高表達，22例（37.2%）低表達，見圖1。

圖1 免疫組化檢測胰腺癌中 SMC1A的表達情況×200Fig.1 Immunohistochemistry of SMC1A expression in pancreatic cancer tissue ×200

2.2 SMC1A表達與臨床指標的關系

結果顯示，SMC1A表達與患者腫瘤大小（χ2=4.515，P=0.034）、T分期（χ2=10.277，P=0.003）及UICC分期（χ2=3.940，P=0.047）正相關，見表1。

表1 SMC1A表達與胰腺癌患者臨床指標的關系［n（%）］Tab.1 Relationship between SMC1A expression and clinical data in patients with pancreatic cancer ［n（%）］

2.3 患者各項臨床指標與預后的關系

Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示，SMC1A高表達胰腺癌患者較低表達者預后差，見圖2。單因素分析結果顯示，SMC1A表達、血管浸潤、UICC分期與患者預后相關（表2）。將單因素分析有統計學意義（P＜ 0.05）指標進行多因素分析，結果顯示，SMC1A高表達 ［95%CI：1.011～5.207，P=0.047］ 和UICC分期晚 ［95%CI：1.209～5.342，P=0.014］ 是患者預后的獨立危險因素。

表2 各項臨床指標對預后影響的單因素及多因素分析Tab.2 Univariate analysis and multi-factor analysis of the influence of various clinical indicators on prognosis

圖2 SMC1A低表達和高表達患者的 Kaplan-Meier生存曲線分析Fig.2 Kaplan-Meier survival curve analysis of patients with low and high SMC1A expression

2.4 SMC1A在胰腺癌細胞系中表達以及SMC1A干擾效果驗證

結果顯示，SMC1A在轉移性胰腺癌細胞AsPC-1及SW1990中蛋白和mRNA表達明顯高于原發胰腺癌細胞（PANC-1和BxPC-3，均P＜ 0.01），見圖3。提示SMC1A表達與胰腺癌侵襲轉移密切相關。AsPC-1和SW1990細胞中SMC1A干擾實驗結果顯示，siRNA組SMC1A蛋白和mRNA表達水平均顯著低于其對照組，見圖4。

圖3 不同胰腺癌細胞中SMC1A 蛋白及mRNA表達比較Fig.3 Comparison of SMC1A protein and mRNA expression in different pancreatic cancer cells

圖4 AsPC-1和SW1990細胞中SMC1A干擾后表達情況Fig.4 Expression of SMC1A after interference in AsPC-1 and SW1990 cells

2.5 SMC1A干擾對胰腺癌細胞增殖的影響

結果顯示，在AsPC-1和SW1990中與對照組比較，轉染后3～5 d SMC1A siRNA組細胞增殖率顯著降低（均P＜ 0.05），見圖5。

圖5 SMC1A干擾對胰腺癌細胞增殖的影響Fig.5 The effect of SMC1A interference on the proliferation of pancreatic cancer cells

3 討論

SMC1A是凝聚蛋白復合體重要亞基，在染色體凝聚過程中防止姐妹染色單體提前分裂，維護子細胞染色體穩定性。SMC1A表達失調可引起染色體不穩定，與腫瘤發生密切相關［6-7］。本研究結果顯示，胰腺癌組織中SMC1A表達明顯升高，且SMC1A高表達與腫瘤大小、T分期及UICC分期正相關（均P＜0.05）；同時SMC1A表達是影響胰腺癌預后的獨立危險因素。已有研究顯示，SMC1A依據腫瘤類型不同發揮不同生物學作用。ZHANG等［5］研究顯示在78例肝癌組織中SMC1A呈明顯高表達，并且與肝癌患者臨床分期及不良預后密切相關。WANG等［8］在427例大腸癌組織中同樣發現SMC1A高表達，其高表達與患者淋巴結轉移、TNM分期、遠處轉移及不良預后顯著正相關。H?MME等［9］在116例急性髓性白血病患者中發現SMC1A呈明顯低表達，并與患者不良預后密切相關。本研究發現SMC1A表達與胰腺癌細胞轉移密切相關，同時SMC1A干擾抑制了胰腺癌細胞增殖。與以往研究［3，5］結果一致。已有研究［10］顯示，前列腺癌中SMC1A的干擾抑制了PC-3和DU145細胞的生長、菌落形成和細胞遷移能力。可見，實體腫瘤中SMC1A扮演癌基因角色，其表達失調可促進腫瘤的進展。

綜上所述，SMC1A在胰腺癌中呈高表達，且SMC1A表達與腫瘤大小、T分期、UICC分期及不良預后密切相關，其機制可能是SMC1A表達促進了胰腺癌細胞增殖。目前，胰腺癌惡性生物學行為的分子機制尚不明確，SMC1A可作為胰腺癌靶向治療的有

效靶點，但有待于進一步研究論證。