長鏈非編碼RNA調控CD4+T淋巴細胞增殖分化和在免疫性疾病中的最新研究進展

劉立民，劉雪香，鄒 燕，黃志卓

（柳州市工人醫院/廣西醫科大學第四附屬醫院醫學檢驗科，廣西柳州 545005）

1 lncRNA 概述

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lnc RNA）是一類長度超過200 nt 且無編碼蛋白能力的RNA 序列。lncRNA 轉錄過程與信使RNA 類似，主要由RNA 聚合酶II 參與，部分lncRNA 進行轉錄后修飾，形成3’poly 加尾和5’cap 帶帽結構。lncRNA 的表達通常具有細胞特異性和時空特異性，其可分布在細胞核或細胞質或者兩者中均有。lncRNA 在轉錄、轉錄調節、翻譯以及翻譯后的修飾等水平，通過多種機制如基因組因子、染色體重塑、作為海綿體吸附微小RNA，作為中間體連接RNA 與蛋白和DNA 形成調控復合物等，調控細胞的凋亡、增殖、發育、成熟和分化[1]。lncRNA 在免疫細胞和免疫性疾病的作用和機制的研究處于起步階段，是醫學領域的研究熱點。

2 lncRNA 與CD4+T 淋巴細胞

CD4+T 淋巴細胞在適應性免疫反應起到關鍵調節作用，主要包括Th1, Th2, Th17, Tfh, Th9, Th10, Th22, Treg 和Tfr 等[2]。CD4+T 細胞相互配合共同維持適應免疫應答的平衡。機體免疫功能異常致CD4+T 細胞亞群比例失調，可能引起免疫失衡甚至引起免疫性疾病[3]。lncRNA 在調控CD4+T 細胞的增殖分化和功能研究以及在相關免疫性疾病的作用已有報道，本綜述簡要匯總lncRNA 在調控CD4+T細胞增殖分化和在免疫性疾病中的研究進展。

2.1 lncRNA 與Th1 細胞 Th1 細胞主要參與抗病毒、細胞內細菌的細胞免疫和遲發型超敏反應等[4]。通過人的T 細胞亞群RNA-seq 數據分析，linc-MAF-4 被鑒定出來，定位在MAF 基因（Avian musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog，MAF）上游139.5kb。linc-MAF-4 是Th1 細胞特異性表達的lncRNA，主要功能是抑制MAF 的表達。linc-MAF-4 直接與果蠅zeste 基因增強子的人類同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）和賴氨酸特異性組蛋白脫甲基酶1A（lysine-specific histone demethylase 1A，LSD1）相互作用形成復合物沉積在MAF 的啟動子區域，增強MAF 的H3K27 me3 水平沉默MAF 表達。人外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）敲除linc-MAF-4 后，引起CD4+T 細胞向Th2 細胞分化偏移。人的naive CD4+T 細胞過表達linc-MAF-4 后，可促進Th1 細胞分化并抑制Th2 細胞分化，上述研究表明linc-MAF-4 促進Th1 細胞分化的重要分子之一[5]。NeST（Nettoie Salmonella pasTheiler’s，NeST）也是Th1 細胞特異表達的lncRNA，位于干擾素-γ 基因（interferon-γ，IFN-γ）的反義鏈上。在人和鼠的CD4+T 細胞體外誘導分化中發現IFN-γ 和NeST 在Th1 細胞表達最高。體外誘導D011.10.Stat4 ?/? 和DO11.10.Tbx21 ?/?小鼠的Th1 細胞，IFN-γ 和NeST 在Th1 細胞的表達均顯著降低。在NeST 敲低后的細胞，IFN-γ 的表達降低。ChIP-qPCR 實驗證明NeST 與WDR5 相互作用。在過表達NeST 的小鼠模型，明顯促進IFN-γ的表達，并且IFN-γ 轉錄調控區的H3K4 me3 的水平增加[6]。因此，Th1 細胞的NeST 對IFN-γ 的表達發揮了重要作用。NKILA（NF-κB-interacting long noncoding RNA，NKILA)是一種與NF-κB 相互作用的長鏈非編碼RNA，通過抑制NF-κB 活性調節T 細胞對活化誘導細胞凋亡的敏感性。T 細胞受體信號激活引起鈣離子流向T 細胞的激活鈣調蛋白，引起NKILA 啟動子區去乙?；笢p少進而增強STAT1 介導的轉錄。

2.2 lncRNA 與Th2 細胞 Th2 細胞協助B 細胞誘發體液免疫應答、清除細胞外微生物和腸道蠕蟲等寄生蟲。Th2 細胞參與抗體類別轉換促進產生IgE，引起或維持過敏反應。在IL-4 刺激下，誘導STAT6 磷酸化，激活Th2 細胞特異性轉錄因子GATA3，引起Th2 細胞分化[7]。在Th2 細胞中特異性表達的lncRNA GATA3-AS1 位于GATA3 基因的反義鏈上，是反義lncRNA，主要分布在細胞核中。在PBMC 中通過小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）敲除GATA3-AS1，體外Th2 誘導分化條件下，GATA3，IL-13 和IL-5 的mRNA 和蛋白水平都明顯降低。ChIP-qPCR 實驗顯示，細胞敲除GATA3-AS1 后，GATA3 和GATA3-AS1 基因的H3K4 me2/3 和H3K27ac 的修飾水平降低。具體機制是GATA3-AS1 和GATA3-AS1 內含子DNA形成R 環，同時GATA3-AS1 與染色質修飾蛋白MLLH3k4 結合，抑制目的基因轉錄。雖然GATA3-AS1 不能誘導Th2 表型，但是GATA3-AS1 不僅調節GATA3 和Th2 效應細胞因子IL-5 和IL-13 的表達，而且可以修飾GATA3 和GATA3-AS1 的染色質分布[8]。lincRNA LincR-Ccr2-5’AS 在Th2 細胞中特異性高表達，調控Th2 細胞特異表達的基因和Th2 細胞的遷移。在Th2 細胞中通過使用短發夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）敲 除LincR-Ccr2-5’AS 后，Th2 細胞表面分子CCR1，CCR3，CCR2，CCR5表達下降；C57BL/6 小鼠敲除LincR-Ccr2-5’AS 基因后，肺部遷移的Th2 細胞明顯低于正常對照組。LincR-Ccr2-5’AS 調 控CCR 基因(C-C chemokine receptor，CCR)表達與修飾染色質的可接近性和招募RNA 聚合酶II 無關，但具體的調控機制還不清楚[9]。lncRNA NEAT1（nuclear enriched abundant transcript，NEAT1）促進Th2 細胞的分化，RIP 實驗證明NEAT1 與EZH2 結合，被募集到ITCH 啟動子區域，抑制ITCH 表達，降低STAT6 泛素化，促進了IL-4，IL-5 和IL-13 的表達[10]。TH2-LCR（locus control region，LCR）是一組lncRNA 簇，人類編碼Th2-LCR lncRNA 基因與RAD50 基因重疊，小鼠的與TH2 基因座控制區（LCR）相鄰。TH2-LCR 在Th2 細胞中特異性高表達，主要分布在細胞核中，包含四種可變剪切序列，調控Th2 細胞分泌IL-4，IL-5，IL-13 的表達[11]。

2.3 lncRNA 與Th17 細胞 Naive CD4+T 細胞在IL-1β，IL-6，IL-23 和TGF-β 等細胞因子刺激下，激活SOCS1，SMAD7 和STAT3 信號，引起RORγt 轉錄因子高表達，分泌IL-17，IL-17F 和IL-22細胞因子，分化為Th17 細胞[12]。lncRNADDIT4主要表達在Th17 細胞中，位于DDIT4 基因(DNA damage-inducible transcript 4，DDIT4) 的下游，提示lncRNADDIT4 具有潛在調控功能。DDIT4是胞漿蛋白，在DNA 損傷中表達上調且抑制mTORC1（mechanistic target of rapamycin complex 1，mTORC1）的激活[13-14]。人naive CD4+T 細胞中敲除lncRNADDIT4，在Th17 的誘導條件下，DDIT4 表達降低、DDIT/mTOR 信號增強且促進Th17 細胞分化。相反，人naive CD4+T 細胞中過表達lncRNADDIT4，在Th17 誘導條件下，DDIT4 表達增加、DDIT/mTOR 信號減弱且Th17 抑制細胞分化。NEAT1 調控Th17 細胞分化，當敲除NEAT1后，可促進下游分子STAT3 泛素化，抑制Th17 細胞分化[15]。IL-23/STAT3 信號通路在促進Th17 細胞分化中起到主要作用。lncRNA-1700040D17Rik是EAE 模型小鼠的lncRNA 微陣列篩選表達降低的lncRNA；內源性IL-23 拮抗劑rhIL23R-CHR 處理EAE 模型小鼠后，lncRNA-1700040D17Rik 表達顯著增加。lncRNA-1700040D17Rik 通過調控Th17 細胞的RORγt 表達，影響Th17 細胞分化。lncRNA-1700040D17Rik 調控Th17 細胞分化，可能作為自身免疫性疾病的治療靶標或生物標志物[16]。通過微陣列熱圖篩選哮喘患者的外周血CD4+T 細胞表達的差異lncRNA 和microRNA，發現lncRNAMEG3 明顯升高，microRNA-17 明顯下降。CD4+T細胞敲除lncRNA-MEG3 后，抑制Th17 細胞分化；過表達lncRNA-MEG3 后，促進Th17 細胞分化。MicroRNA-17 作用于靶基因RORγt，引起RORγt mRNA 穩定性下降。lncRNA-MEG3 通過抑制microRNA-17 的水平，促進RORγt 的mRNA和蛋白表達，提示lncRNA/microRNA 軸可能在疾病的臨床治療和診斷中具有潛在的應用價值[17]。

2.4 lncRNA 與Treg 細胞 NaiveCD4+T 細胞在IL-2 和TGF-β 等細胞因子刺激下分化為Treg 細胞。Treg 細胞高表達的Foxp3，激活SOCS1，SMAD3，STAT3，STAT5 和mTOR 信 號，促 進TGF-β 分泌，在維持免疫自穩定和自身耐受中發揮作用[18]。Flicr 是Treg 細胞中特異性低表達的lncRNA，位于Foxp3 轉錄起始位點上游1.8kb。通過CRISPR/Cas9技術敲除Flicr，Treg 細胞的Foxp3 轉錄增加，說明Flicr 抑制Treg 細胞Foxp3 表達。Flicr 抑制Foxp3基因表達的機制是CNS2（conserved noncoding sequence，CNS）的增強子區域內CpG 簇處的甲基化水平增加，進而抑制了染色質可及性。IL-2 招募轉錄因子STAT5b 到Foxp3 基因座，穩定Foxp3的表達。Flicr 和IL-2 在維持Treg 細胞數量動態平衡中發揮相反的作用[19]。lncRNA-EGFR(epidermal growth factor receptor，EGFR)在Treg 細胞表達上調并且與肝細胞癌腫瘤大小和EGFR/Foxp3 的表達呈正相關，與IFN-γ 表達呈負相關。lncRNAEGFR 通過EGFR 依賴性方式刺激Treg 細胞分化、抑制CTL 活性并促進HCC 生長。c-CBL（casitas B lineage lymphoma，c-CBL）是激活下游AP-1/NF-AT1 軸的重要蛋白，通過泛素化的方式降解EGFR。lnc-EGFR 與EGFR 特異性結合，降低了c-CBL 引起EGFR 泛素化的水平，有利于腫瘤的生長[20]。乳腺癌患者外周血Treg 細胞比例增加，CD4+T 細胞高表達lncRNA-SNHG1，Foxp3，IL-10和IDO（indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO），低表達miR-448。CD4+T 細胞敲除lncRNA-SNHG1，可以降低Foxp3，IL-10和IDO表達，增加miR-488表達，抑制Treg 細胞分化。RIP 和RNA pull-down 等實驗證明lncRNA-SNHG1 靶向結合miR-448，抑制miR-448 下調IDO 的功能。小鼠敲除lncRNA-SNHG1 的模型顯著的減小腫瘤體積，延緩腫瘤發展[21]。

3 lncRNA 與免疫性疾病

lncRNA 參與免疫性疾病的發生發展過程，在免疫病理和免疫調控中發揮重要作用。本文簡要匯總lncRNA 在免疫性疾病中的研究進展。

3.1 lncRNA 與過敏 在過敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）的發生過程中，Th1/Th2 比例下降。AR患者鼻黏液（AR-EXO）和鼻上皮細胞（OVA-EXO）的外泌體中高表達長非編碼RNAGAS5（LncGAS5）。lncGAS5 抑制Th1 細胞分化并促進Th2 細胞分化。lncGAS5 通過抑制AR-EXO 細胞的EZH2 和T-bet轉錄表達，進而抑制了Th1 細胞分化。因此，AR 上皮來源外泌體中的lncGAS5 是Th1/Th2 分化的關鍵因子，為AR 提供了可能的治療靶標[22]。Th2-LCR lncRNA 調控IL-4，IL-5，IL-13 的表達，影響Th2細胞分化。當敲除Th2-LCR lncRNA 后，CHIPqPCR 實驗顯示招募WDR5 到IL-4，IL-5，IL-13 啟動區的水平明顯下降，引起啟動子區H3K4 me3 明顯降低，導致IL-4，IL-5，IL-13 合成減少。

哮喘患者外周血lncRNA-MALAT1 高表達和miR-155 低表達，引起Th1/Th2 比值降低。在CD4+T 細胞中過表達pcDNA3.1-MALAT1 后，抑制miR-155 表達，同時IFN-γ，IL-2 和T-bet 表達下降；敲除MALAT1 后促進miR-155 表達，IL-4，IL-10 和GATA3表達增加。lncRNA-MALAT1 的表達與Th1/Th2 比例呈負相關，而miR-155 表達與Th1/Th2 比例呈正相關。MALAT1 充當海綿體吸附miR-155，減弱miR-155 降解靶基因的能力。因此，通過調控lncRNA-MALAT1 和miR-155 的表達來調節Th1/Th2 的比例，可能成為治療哮喘的靶點[23]。

3.2 lncRNA 與自身免疫性疾病 類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）患者的PBMC 中Th17細胞的NEAT1 表達升高，小鼠體內注射siRNANEAT1 可以降低Th17 細胞表達，緩解II 型膠原誘導的小鼠關節炎模型的關節炎程度[15]。多發性硬化癥（multiple sclerosis，MS）患者PBMC 的微陣列數據顯示，Th17 細胞中的DDIT4 和lncRNA DDIT4 上調[24]。

免疫性血小板減少性紫癜（immune thrombocytopenic purpura，ITP）患者的PBMC 和ITP 小鼠脾臟細胞中lncRNA GAS5 表達均下調。在Naive CD4+T 細胞中過表達lncRNAGAS5，抑制Th17 細胞分化，但不影響Treg 細胞分化。lncRNAGAS5促進TRAF6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）介導的STAT3 泛素化，抑制Th17 細胞分化并減輕ITP[25]。Treg/Th17 細胞比例平衡在維持免疫穩定中發揮重要作用，但是ITP 患者Treg/Th17 細胞比例存在失衡。ITP 患者外周血CD4+T 細胞的lncRNAMEG3 表達明顯升高。lncRNA-MEG3 直接結合miR-125a-5p，競爭性的抑制了Foxp3 表達，促進RORγt 表達，促使Treg/Th17 細胞比例失衡，引發ITP[17]。

橋本甲狀腺炎（Hashimoto’s Thyroiditis，HT）患者NeST 表達水平與循環Th1 細胞數量，T-bet 和IFN-γ 呈現正相關性，增強Th1 細胞清除病毒和細菌感染的能力[26-27]。

4 小結

lncRNA 在調控CD4+T 淋巴細胞的增殖分化和免疫疾病中具有重要作用。但是其作用和機制研究還不夠全面深入，例如lncRNA 在調控Tfh，Th9，Th10，Th22 細胞功能和機制研究鮮有相關文獻報道。lncRNA 可能成為免疫相關疾病如自身免疫性疾病的預防、診斷及治療提供新的對策。