PCR檢測牦牛肉摻偽技術研究現狀和進展

趙雯瑋，王珊珊，朱肖翔，朱紅波，曹葉偉，尹志娜

（1.西藏自治區食品藥品檢驗研究院，西藏拉薩 850000；2.廣東藥科大學，廣東廣州 510006）

關鍵字：牦牛肉；摻偽；PCR檢測

牦牛（Bos grunniens）因其能夠適應寒冷、缺氧等極端惡劣的條件，長期以來一直是高原山區畜牧業的主要畜類資源之一[1-2]。我國的牦牛資源總量非常豐富，占全世界牦?？倲档?5%以上，主要分布于甘肅青海、四川阿壩、西藏自治區等擁有高山地貌的地區[3-4]。牦牛肉蛋白質含量豐富[5-7]，必需氨基酸占氨基酸總量的35%以上，且大多數必需氨基酸的得分與聯合國糧農組織和WHO推薦的氨基酸模式接近[8]，同時其生長于綠色無污染的天然放牧環境，含有大量對人體有益的微量元素，具有極好的營養價值，故被譽為“牛肉之冠”，價格昂貴[9]。大量的投機者以甘肅集中舍飼牦?；蚱胀ㄅＨ馍踔潦瞧渌庠疵俺潢笈Ｈ饣蛘哧笈Ｖ破帆@利，產生的后果是牦牛肉產品大街小巷到處可見，價格低廉，口感和營養與真實牦牛肉相差甚遠。西藏牦牛肉形象驟降，直接或間接對西藏特色產品對外輸出產生的經濟價值造成巨大影響。PCR（Polymerase Chain Reaction）技術即聚合酶鏈式反應，是利用DNA雙鏈復制的原理，在生物體外大量擴增特定DNA片段的分子生物學技術。PCR技術現已廣泛應用于各類動物食品的鑒定和檢驗，是未來快速高效的檢測方法的重要研究基礎和發展方向。

1 傳統PCR法

最早TARTAGLIA等[10]利用PCR在飼料中進行牛源性成分的檢測。此后又衍生了PCR-RFLP[11]（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段長度多態性）和PCR-SSCP（Single Strand Confor- mation Polymorphism，單鏈構象多態性分析）等技術。常規PCR具有快速、簡便、特異性強的優點，是一種應用廣泛的方法，原理是根據目的片段設計引物在DNA聚合酶和相應儀器作用下體外擴增部分或全部目的片段。缺點是對于檢測技術人員的要求比較高，操作冗繁，需要嫻熟的技術人員進行操作，不容易出結果。段慶梓等人[12]通過牦牛與其他常見物種Cytb基因的序列比對，設計牦牛特異性引物，并對PCR體系中不同條件、參數進行考察，最終建立了牦牛源性檢測的PCR方法。通過牦牛與豬肉、水牛和黃牛不同比例混合肉樣檢測方法的研究，該體系對牦牛源性的檢測低限可達到1%。同時，建立的牦牛特異性PCR鑒別體系對市售的牦牛肉制品有較好的方法適應性。杜倩男[13]等人用PCR-SSCP方法大規模檢測九龍公牦牛β-酪蛋白基因型，實驗結論為九龍牦牛公牛中CSN2基因的A1A1、A1A2和A2A2的基因型頻率分別為6.9%，0.09.8%， 83.3%，A2A2型（n=85）占絕對優勢；A1和A2等位基因頻率分別為13.2%和86.8%，說明PCR-SSCP方法可靠，能大規模檢測九龍牦牛β-CN的基因型。胡強[14]等人采用一對通用引物擴增細胞色素b基因中一段長度為 421 bp的序列，并進行了克隆測序。結果顯示，通用引物能很好地擴增不同動物細胞色素b基因，擴增片段序列在牦牛與黃牛之間存在差異較大，能用于這兩種肉的鑒定；而在金堂黑山羊、白玉黑山羊和美姑黑山羊之間差異非常小。以上研究建立了PCRRFLP方法鑒定牦牛和黃牛肉，這對于動物保護以及來源不明的肉類產品的區分具有實際應用價值。細胞色素b基因同源性比較顯示：在所擴增的細胞色素b基因的保守區中，牦牛與黃牛間的序列差異為7.9%，與金堂黑山羊、白玉黑山羊和美姑黑山羊的序列差異在16.5%～17.2%，表明動物種屬間序列差異較大；牦牛與犏牛的序列相同，犏牛為牦牛（母）與黃牛（公）雜交后代，表明線粒體DNA為嚴格的母系遺傳；金堂黑山羊、白玉黑山羊和美姑黑山羊間的序列差異在0.2%～0.7%，表明山羊品種間的序列差異極小。實驗結果表明，采用設計的通用引物便于進行動物種屬鑒定，但是無法區分山羊的品種或牦牛的雜交后代。

2 實時熒光定量PCR法

實時熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。具有以下優點：經過特定比對后設計出的引物和探針可減小假陽性的發生概率；即使肉制品經過深度加工而導致其DNA發生一定程度的裂解，目標基因的擴增也不會受到影響，可進行快速批量檢測，適用于樣品量較大的肉源性檢測工作[15]。定量實時PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）的產生，免去了PCR技術后續凝膠電泳的步驟，同時能對整個PCR反應過程進行實時監測，因此該方法目前已成為一種較普及的用于鑒別肉制品真偽的方法[16]。蘇葳藝[17]應用多重PCR方法鑒別牛肉中摻雜其他肉類，試驗建立的復式PCR方法特異性強，操作簡便，對于牛肉中摻雜雞肉、豬肉、鼠肉的檢出限均達到1%摻雜量。目前已有的關于肉源性成分鑒別的方法已經較多[18-19]，優點是能快速識別不同源性成分及其摻假比例。但目前部分方法仍存在靈敏度相對不高的情況，同時儀器成本較高，導致應用和覆蓋度不高。

3 結語

傳統的牦牛肉真偽檢測主要進行感官評價、營養成分分析或者采用其他電化學及免疫化學法，但都不如PCR技術專一、高效和準確。傳統PCR存在著操作復雜、耗時長、操作技術水平要求高以及不穩定因素多等缺點。而實時熒光定量PCR技術則具有快速、敏感、特異以及操作簡單等優點，同時能夠鑒別出是源性成分種類以及摻假比例等，是目前最先進和最穩定的檢測方法。但實時熒光定量PCR檢測設備價格昂貴，在甘肅等大型養殖場尚且可以推廣，而西藏地理結構特殊，主要采用自然放牧散養規模類型，因此并不適合推廣和應用。課題組試圖探索到一些對西藏本土企業比較適用、成本價格以及技術要求相對比較低的方法。課題組已建立了等溫擴增技術LAMP鑒別牦牛肉的方法，雖然目前正在克服假陽性的問題，但針對西藏地區的需求考慮，其優越性也是顯而易見的。