水產品中創傷弧菌檢測方法的研究進展

彭鐘琴，黃 璐

（廣東茂名農林科技職業學院，廣東茂名 525000）

淡水和海水的水體中含有多種天然存在的微生物，水產品在捕獲和加工過程中也會受到污染而攜帶致病菌。魚貝類等水生生物由于體表分泌含有糖蛋白的黏質物，使其成為微生物良好的培養基。魚貝類的皮膚和鰓等部位直接與水體接觸會沾染攜帶水體中的微生物，如弧菌、假單胞菌、黃桿菌和無色桿菌等細菌，以及甲型肝炎病毒、諾瓦病毒等病毒。當魚貝類生物死亡后，附著在體表的微生物會大量繁殖引起水產品腐敗變質，若水產品被沙門氏菌、葡萄球菌、大腸桿菌、志賀氏菌等污染，還會引發多種細菌性食物中毒。捕獲后的水產品在銷售過程中也會受微生物污染，如受到漁船的甲板、魚箱、人手、加工廠環境等污染，被稱為繼發性污染。因此，水產品的微生物污染與食品安全有著密切的關系。水產品安全不容忽視，為了較好地控制水產品的質量安全，確保消費者的飲食安全，水產品必須經過嚴格的微生物檢驗并達標后才能進入市場[1]。

1 創傷弧菌生物學特性

創傷弧菌屬弧菌科弧菌屬，是革蘭氏陰性嗜鹽性弧菌，無芽孢，以極生單鞭毛運動，菌體大小為（0.5～0.8）μm×（1.4～2.6）μm，彎桿狀。該菌在TCBS培養基中培養時，無法進行蔗糖的酵解，因而形成菌落著色呈綠色、光滑濕潤、水珠樣，此特性可用作快速鑒別[2]。該菌自然生存于河海交界之處，易感染各種水產動物，如魚、蝦、蟹、牡蠣、蛤、蚶及螺等，是水產養殖中重要的細菌性病原之一，對人的感染多通過污染的海產品，引起的食物中毒多發生在6—10月[3]。創傷弧菌是一種人畜共患病的重要病原菌，危害人類健康，可引起嚴重的原發性敗血癥和胃腸炎的疾病，病死率達50%以上，發病原因是人們食用了受創傷弧菌感染的海產品，或在捕撈或清洗魚、蝦、蟹、貝類時受到創傷弧菌的感染[4]。

創傷弧菌對熱敏感，烹飪過程中可將其殺滅。食用未經烹飪的海鮮或海產品加工處理不徹底或因交叉污染海產品被該菌重復污染，會使創傷弧菌大量繁殖，引起創傷弧菌食物中毒。

2 創傷弧菌的檢測

創傷弧菌具有高致病性危害，是水產養殖和進出口水產品重點檢驗檢疫的致病菌。嚴格開展微生物檢驗對提高食品和水產品的質量安全，保證人體健康、維護我國的政治信譽和經濟利益，促進對外貿易的發展都具有重要意義。

2020年，國家首次制訂創傷弧菌的國家新標準《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 創傷弧菌檢驗》（GB 4789.44—2020），引起了社會的廣泛關注。該標準結合傳統的生化鑒定和PCR檢測對水產品中的創傷弧菌進行檢測，規定了對水產品中創傷弧菌的檢驗方法，適用于魚、蝦、蟹、貝類等水產品中創傷弧菌的檢驗。此前，國家頒布過兩項行業標準：PCR法和實時PCR法。

2.1 常規分離鑒定

在同樣條件下，用蛋白胨-氯化鈉-纖維二糖-多黏菌素E（PNCC）增菌液作為樣品處理優于用3%氯化鈉的堿性蛋白胨水（APW）增菌液。HSU等[5]發現蛋白胨-氯化鈉-纖維二糖-多黏菌素E（PNCC）增菌液，可抑制溶藻弧菌、銅綠假單胞菌、副溶血弧菌、大腸埃希氏菌等非目標菌的生長，用于創傷弧菌的選擇性增菌培養。樣品增菌后，接種于mCPC瓊脂（改良纖維二糖-多黏菌素B-多黏菌素E）和CC瓊脂（纖維二糖-多黏菌素E）2種選擇性培養基，也可接種于TCBS瓊脂（硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂）、SPS瓊脂（磷酸鹽緩沖液）、CPC瓊脂、VVM瓊脂、VVM瓊脂或VVA瓊脂等選擇培養基，在（36±1）℃條件下培養（18±1）h。TCBS瓊脂培養基最初主要用于分離致病菌，在pH值為8.6的條件下，牛膽汁和NaCl可抑制假單胞菌等非目標菌的生長繁殖[6]。

2.2 生理生化鑒定

因創傷弧菌有明顯區別于其他弧菌的生化特征，可利用生化分析結果進行初步鑒定。創傷弧菌的乳糖、β-半乳糖苷酶陽性，在含8%氯化鈉的蛋白胨水中不生長，而副溶血弧菌和溶藻弧菌的乳糖、β-半乳糖苷酶陰性，在含8%氯化鈉的蛋白胨水中生長。結合革蘭氏染色鏡檢觀察形態、氧化酶試驗、三糖鐵試驗和嗜鹽性試驗對可疑菌落進行初步鑒定，然后可選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統做最終確證實驗。目前，可采用API 20E生化鑒定試劑條或微生物鑒定分析系統（美國Biolog）等商業化產品對大量樣品進行鑒定，不僅可以簡化步驟還能提高鑒定的準確率。然而，創傷弧菌可能出現較多的非典型菌株，表型多樣，使生理生化鑒定變得更加復雜。

2.3 免疫生物學檢測方法

TAMPLIN等[7]以創傷弧菌特異性的單克隆抗體為免疫基礎，建立了檢測創傷弧菌的酶免疫法，檢測限達2×104CFU/mL，是美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）檢測創傷弧菌的推薦方法之一。PARKER等[8]根據創傷弧菌分泌至胞外的一種穿孔毒素溶血素（VVH）建立了雙抗體的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法，測定大分子抗原，溶血素（VVH）是創傷弧菌的致病毒力因子之一。ELISA檢測方法是當前應用最廣、發展最快的一項新技術，靈敏度高，無需復雜儀器且操作簡單，應用廣泛。

2.4 常規PCR檢測方法

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種體外擴增特定基因或DNA序列的方法。HILL等[9]基于VVHA基因設計特異引物首次對創傷弧菌進行PCR檢測，選用22株非目標菌株進行了特異性試驗，目標菌株獲得519 bp的擴增條帶，而其他弧菌和非弧菌細菌無特異擴增，檢測限為100 CFU/g。KUMAR等[10]根據gyrB基因設計特異引物對海產品中創傷弧菌進行了PCR檢測，結果顯示，目標菌株都出現一條285 bp的特異性條帶，非目標菌株均為陰性結果。DNA提取前經過3%氯化鈉堿性蛋白胨水進行18 h增菌處理的樣品，檢出限為30 CFU/g，而不經過增菌處理的樣品的檢出限則為300 CFU/g。

2.5 RT-qPCR檢測方法

實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術是重要的基因表達定量方法，具有靈敏度高、靈活度好、實驗門檻低等特點，是實驗室最常用的實驗技術之一。王紫薇等[11]通過RT-PCR法和微生物鑒定藥敏智能系統（VITEK）對在北京市市場隨機采集的105份海產品進行創傷弧菌檢驗，經高度保守的管家基因rpoB基因測序驗證，實時熒光定量PCR法和微生物鑒定藥敏智能系統方法的準確率分別為100%和67.5%。

2.6 LAMP技術

環介導等溫擴增（Loop-mediated Isothermal Am- plification, LAMP）技術，是一種新的DNA擴增方法，LAMP技術發展初期主要應用于食源性微生物的檢測，目前已出現沙門氏菌（Salmonella）、軍團菌（Legionella）、李斯特桿菌（Listeria）和彎曲桿菌（Campylobacter）等微生物的LAMP檢測商品試劑盒。田卓等[12]以創傷弧菌的gyrB基因作為靶基因，優化篩選的引物特異地檢測創傷弧菌，檢測核酸濃度的靈敏度可以達到10-9g/L，在558份水體樣品和655份水產品樣品中，創傷弧菌陽性檢出率分別為0.54%和0.46%，與實時熒光PCR方法的檢測結果符合率為100%。

3 結語

創傷弧菌是水產品中主要的病原菌之一，近年來，有較多由該菌引起的散發病例。研究創傷弧菌的檢測方法對提高食品和水產品的質量安全，保證人體健康具有重要意義。