不同釀酒葡萄品種對小新殼梭孢（N. parvum）的抗性評價及抗性相關酶研究

宋雙，姜彩鴿，王國珍，張怡

（寧夏農林科學院植物保護研究所/寧夏植物病蟲害防治重點實驗室，銀川 750002）

寧夏賀蘭山東麓以釀酒葡萄種植與加工為主導產業，截止2020年底，釀酒葡萄種植面積達3.28萬 hm2，約占葡萄總面積的87%。主栽品種為‘赤霞珠’‘蛇龍珠’‘品麗珠’‘美樂’‘西拉’‘黑比諾’‘霞多麗’‘貴人香’，其中紅色釀酒品種占釀酒葡萄面積的90%以上[1]。

葡萄潰瘍病（Grape canker）主要由葡萄座腔菌屬的真菌（Botryosphaeriasp.）引起，在世界范圍內造成重大經濟損失[2-4]。病原菌可以在病枝條、病果等組織上越冬，病菌主要通過傷口進行侵染，包括修剪枝條產生的傷口等；新鮮的傷口更容易被病菌侵入，樹勢弱、負載量大的葡萄樹易感[5]。其中小新殼梭孢（N. parvum）是引起葡萄潰瘍病的最具攻擊性的病原菌之一[6-7]，潛伏在葡萄樹的細胞和組織中，導致木質部潰瘍的形成，造成葉片的黃化和壞死，嚴重時出現 “死樹”，表現枝干潰瘍，果梗干枯和掉粒[8-9]。賀蘭山東麓葡萄園中潰瘍病的發生比例不高，在疏于管理、水肥條件差的葡萄園發生較重。但由于病株呈散點式分布在葡萄園中，極易造成潰瘍病流行蔓延的風險。

試驗以賀蘭山東麓主要釀酒葡萄品種為材料，通過室內刺傷法接種綠枝條，對其進行抗性評價，同時測定接種后各品種葉片內抗性相關酶的活性，以期了解當地主要釀酒葡萄品種的抗病性，為開展釀酒葡萄抗病品種選育提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試品種

13個釀酒葡萄品種：赤霞珠、蛇龍珠、品麗珠、美樂、霞多麗、西拉、馬瑟蘭、黑比諾、長相思、威代爾、貴人香、小味兒多、維歐尼。

1.1.2 供試菌株

小新殼梭孢（N. parvum）菌株：由北京市農林科學院植物保護環境保護研究所提供。將供試菌株活化后，轉入直徑90 mm培養皿中的PDA培養基中，在25 ℃的培養箱中培養72 h，距離菌落邊緣10 mm處用5 mm消毒打孔器取菌餅，備用。

1.1.3 供試葡萄盆栽苗

‘黑比諾’‘赤霞珠’‘小味兒多’‘霞多麗’4個品種苗盆栽，均來自寧夏欣欣向榮苗木有限公司望洪基地。盆栽苗置于溫度不低于20 ℃的溫室內，保持濕度，待長勢一致，在地上部分有9～10片葉時進行試驗。

1.1.4 菌懸液制備

供試菌株活化培養48 h后，挑取單菌落接種于LB液體培養基中，溫度25 ℃，振蕩頻率為200 r/min，搖床過夜培養。將培養好的菌懸液用無菌水調至3×108cfu/mL備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 離體枝條接種

13個品種的綠枝均采自賀蘭金山葡萄種植區。步驟如下：選取1年生健康綠枝，摘除葉片，修剪至30～35 cm并含4～5個節。在距離枝頂15 cm處用5 mm消毒打孔器打孔去除韌皮部，取1.1.2制備好的菌餅接種于傷口處，用保鮮膜包扎保濕，每品種處理10個枝條，重復3次。以同樣大小的無菌PDA菌餅作對照。接種后的綠枝下端做馬蹄形修剪，頂端平行修剪，插入裝有滅菌蛭石的營養缽中，置于溫室（光照25 ℃/12 h，黑暗18 ℃/12 h，相對濕度80%）培養，蛭石保持濕潤，每天觀察枝條發病情況[10-11]。

1.2.2 盆栽苗接種

接種‘黑比諾’‘赤霞珠’‘小味兒多’‘霞多麗’盆栽苗各6株，每株選取大小均勻長勢良好的3片葉，將制備好的菌懸液均勻噴在葉上，并套上保鮮袋。在每株葡萄主莖的地上部用解剖刀切1個2 cm2的方形傷口，用沾有菌懸液的脫脂棉裹在傷口處，包上保鮮膜[12-13]。同樣用各品種的6株健康苗作對照處理。

1.2.3 盆栽苗抗性相關酶活性測定

于接種10 d后取樣。摘取去除病斑和葉脈的葉片，對照取健康植株的相同部位，準確稱取鮮樣0.5 g用于制備酶粗提液。過氧化氫酶（CAT）活性的測定用紫外分光光度法；超氧化物歧化酶（SOD）活性測定用NBT光還原法；過氧化物酶（POD）活性測定用愈創木酚法[14]。

1.2.4 調查方法與統計分析

抗病性調查：每天觀測病害潛育期，在接種后第10天測量病斑長度，觀察是否在枝條上產生子實體。試驗數據使用Excel 2016和DPS 18.10分析軟件進行統計和相關分析。

2 結果與分析

2.1 不同釀酒葡萄品種對N. parvum抗性評價

2.1.1 不同釀酒葡萄品種對N. parvum的抗性分析

根據N. parvum的侵染斑大小和子實體產生有無以及潛育期對13個品種進行抗性分析，其結果如表1。

由表1看出，13個品種對N. parvum的致病性存在顯著差異。‘霞多麗’對N. parvum表現為高感，潛育期1 d，病斑大小21.61 cm，接種后不但菌斑擴增很大，而且產生子實體；‘小味兒多’對N. parvum表現為感病，接種潛育期2 d，病斑大小15.21 cm；‘貴人香’‘蛇龍珠’‘赤霞珠’‘馬瑟蘭’‘西拉’‘美樂’6個品種對N. parvum表現屬于中間型；‘維歐尼’‘長相思’‘黑比諾’‘威代爾’‘品麗珠’對N. parvum表現為抗病，接種后菌斑沒有擴增或者擴增很小，潛育期長。

表1 N. parvum在13個釀酒葡萄品種上的致病性Table 1 Pathogenicity of N. parvum on 13 wine grape varieties

2.1.2N. parvum在13個品種上侵害的聚類分析

根據聚類分析結果，取閾值為10.75時，13個品種被聚為4類，Ⅰ類：維歐尼、長相思、黑比諾、威代爾、品麗珠；Ⅱ類：貴人香、蛇龍珠、赤霞珠、馬瑟蘭、西拉、美樂；Ⅲ類：小味兒多；Ⅳ類：霞多麗。由表2可以看出，4大類型品種對N. parvum的抗性存在顯著性差異，各類型總體平均值的差異達到極顯著水平，抗性大小依次為：Ⅰ類型＞Ⅱ類型＞Ⅲ類型＞Ⅳ類型。

表2 13個釀酒葡萄品種抗性類型Table 2 The types of 13 wine grape cultivars

2.2 各品種接種N. parvum后抗性相關酶活性

2.2.1 CAT活性變化

CAT能催化H2O2分解為H2O和O2，從而減輕過量的H2O2對植物細胞造成的氧化損傷。因此，在抗病性反應過程中H2O2的消耗量可以用來判斷CAT在植物抗病性中的作用。由圖2可知，接種N. parvum后，各品種葉片中CAT活性都呈上升趨勢，且高抗品種‘黑比諾’和抗病品種‘赤霞珠’的CAT活性上升幅度明顯高于低抗品種‘霞多麗’和中抗品種‘小味兒多’。接種10 d后，‘黑比諾’‘霞多麗’和中抗品種‘小味兒多’葉片中CAT活性分別上升29.52%、5.06%、19.50%。前人的大量研究表明，CAT活性越強則植物的抗病性也越強。高抗品種‘黑比諾’接種N. parvum后CAT活性與對照相比顯著增加；但低抗品種‘霞多麗’增加不顯著，且對過氧化氫的親和力較弱，因此催化H2O2分解成H2O和O2能力較弱，N. parvum抗性較弱。

圖1 13個釀酒葡萄品種抗N. parvum的聚類分析圖Figure 1 Clust pedigree figure for N. parvum resistance in 13 wine grape cultivars according to resistant indexes

圖2 感染N. parvum后葡萄葉片CAT活性的變化Figure 2 Change of CAT activity in leaves of different varieties inoculated with N. parvum

2.2.2 SOD活性變化

植物體內存在的SOD是一種典型的誘導酶，逆境條件是植物體內SOD活性變化的重要誘因。由圖3可知，接種N. parvum后，各品種葉片中SOD活性都升高，SOD活性上升幅度最大為高抗品種‘黑比諾’（92.79%），其次是抗病品種‘赤霞珠’（85.58%），上升幅度最小的為低抗品種‘霞多麗’（45.61%）。多數研究認為，SOD活性與抗病性存在正相關。本試驗結果表明，枝條接種N. parvum后，各品種的SOD活性均有升高的趨勢，這是因為加速了病原菌脅迫植物產生的超氧陰離子自由基歧化分解為分子氧和過氧化氫的過程，因此高抗品種‘黑比諾’比低抗品種‘霞多麗’升高幅度更大。

圖3 感染N. parvum后葡萄葉片SOD活性的變化Figure 3 Change of SOD activity in leaves of different varieties inoculated with N. parvum

2.2.3 POD活性變化

一般認為，在植物被病原菌感染后，POD活性明顯增強。高活性的POD能催化殺菌物質的合成，提高木質素和木栓質的生物合成，形成物理屏障，并參與乳突期。POD活性的大小與果實抗病性的形成和顆粒狀沉積物的積累，以及寄主抗病性的增強有關。因此，POD經常被用作植物抗性強弱的重要指標。由圖4可知，感染N. parvum后，各釀酒葡萄品種葉片中POD活性都升高，高抗品種‘黑比諾’上升幅度較大，POD活性比接種前上升74.34%；中抗品種‘小味兒多’葉片中POD活性上升較緩慢，POD 活性比接種前上升59.59%；低抗品種‘霞多麗’POD活性上升幅度較小，POD 活性分別比接種前上升30.81%。本試驗表明：4個釀酒葡萄品種接種N. parvum后POD活性水平顯著高于對照。高抗品種‘黑比諾’比低抗品種‘霞多麗’上升的幅度更大。

圖4 感染N. parvum后葡萄葉片POD活性的變化Figure 4 Change of POD activity in leaves of different varieties inoculated with N. parvum

3 討論與結論

不同釀酒葡萄品種對N. parvum的抗性差異顯著。然而，關于釀酒葡萄品種的抗病性等級標準尚未見報道，該標準的確定對與釀酒葡萄抗病性研究尤為重要。本研究通過對13個釀酒葡萄品種的抗性評價發現，接種N. parvum后，抗病品種‘黑比諾’病斑擴展速度慢，顯癥時間晚，于接種后4 d出現輕微病斑，10 d后達到最大且不再擴展；而‘霞多麗’顯癥時間早（1 d），病斑擴展速度快。‘黑比諾’的病斑長度最小平均為9.00 cm，而‘霞多麗’病斑長度最大平均為21.61 cm，說明‘黑比諾’表現出的抗性強于‘霞多麗’，這與我們在田間觀察到的結果相一致。對潰瘍病N. parvum的聚類分析結果進行綜合分析，篩選出對N. parvum抗性較好的品種，對釀酒葡萄品種的推廣具有指導意義。根據不同地區的葡萄潰瘍病病原菌種類和發生程度，選用使用抗性強的品種。

植物體內存在自由基清除系統，該系統包括酶保護系統和非酶保護系統。CAT、SOD和POD作為酶保護系統的一部分，在抵御病原侵染和作用脅迫方面發揮著重要作用[15]。植物抗病性是在寄主與病原體相互作用過程中產生的一系列生理和生化效應，而高抗品種的反應常常比低抗品種的反應更為強烈。本試驗中‘黑比諾’葉片內CAT、SOD和POD活性明顯高于‘霞多麗’，就證實了這一點。

本研究中高抗品種在感病后CAT、SOD和POD的活性均顯著提高，且高于低抗品種，與抗病性成正相關。大量研究表明，CAT活性越強則植物的抗病性也越強[16-19]。本研究中，抗病性較強的‘黑比諾’和‘赤霞珠’接種后CAT活性比對照顯著增加，但‘小味兒多’和‘霞多麗’增加不顯著。POD參與木質素的合成，細胞壁木質化程度高對病原菌的侵染和擴展有一定的限制作用。抗病品種葉片受病原菌侵染后POD活性升高，可能有利于木質素的合成，從而增強其抗侵染或擴展的能力[17]。雖然感病品種發病后葉片的酶活性也有所上升，但上升幅度不大，可能不利于木質素的合成。本試驗表明，不同釀酒葡萄品種接種N. parvum后POD活性水平均高于對照，在‘黑比諾’中遠高于‘霞多麗’。SOD是對抗活性氧的“第一道防線”，當病原菌感染時，SOD活性升高，消除病原菌刺激產生的自由基，使細胞內維持一個有利于生長的穩定環境[18]。試驗表明，枝條接種N. parvum后，不同釀酒葡萄品種的SOD酶活性均有明顯的升高趨勢，高抗品種上升的幅度比低抗品種上升幅度更大。