豐花月季杏花村組培快繁條件篩選

任杰 林榕榕 王燕 梁靜萍 黎經田 李可貴陳冠銘 李宏楊 劉揚

(1三亞市南繁科學技術研究院 海南三亞 572000;2海南玫瑰谷產業發展有限公司 海南三亞 572000;3三亞市熱帶農業科學院 海南三亞 572000;4海南熱帶海洋學院 海南三亞 572000)

月季（Rosa chinensis）是薔薇科薔薇屬的一種常綠或半常綠灌木，顏色多樣，有濃郁的香味，形態各有特點，受到國內外人的喜愛。月季在中國已有2 000年的栽培歷史［1］。據統計，現代月季品種約有24 000種［2］，杏花村屬于現代月季品種之一的豐花月季（Floribunda Roses），又稱聚花月季，1935年Drior用Kirsten Penlsen×Unamed seedling作為親本育出。其適應能力強，長勢好，易管理，花開艷麗，常用于園林綠植。海南三亞的亞龍灣國際玫瑰谷與三亞市南繁科學技術研究院合作，對杏花村引種栽培，發現其適合三亞的氣候環境，但因三亞夏季高溫高濕天氣影響，常規的扦插、壓條、嫁接等繁殖方式成活率低、病毒積累嚴重。阻礙其推廣示范，育苗難問題亟待解決。

早在1980年，Hasegawa［3］就在MS培養基上成功培育出攀援月季Improvedfire，證明組培月季可行。組培外植體的選擇通常為生長健壯、芽點飽滿的枝條，少數也采用葉片［4-7］、葉柄［4，8］、葉盤［8］做外植體。在李海燕等［9］研究中，中部莖段腋芽效果最好，平均萌發時間比頂部和基部芽短6～8 d。其次是基部，再是頂部［9-13］。

適宜濃度的植物生長調節劑能有效促進月季腋芽的誘導。Rout等［14］進行腋芽誘導時，發現6-BA的正常有效濃度為0.5～3.0 mg/L。Bressan［10］在研究Gold Glow時，發現當6-BA量超過0.3 mg/L會對側芽萌發起到明顯的抑制，且NAA的有效濃度為 0.01～0.5 mg/L［15-16］。錢蕾［17］在對粉-A 初代培養研究中，添加6-BA 2.0 mg/L和NAA 0.05 mg/L，誘導率為94.61%。莫磊興等［18］研究結果表明，高溫會影響芽的萌發，26℃左右最適芽的萌發。

在腋芽的增殖研究中發現，0.1～3.0 mg/L為6-BA的正常有效濃度，0.3 mg/L為IBA的最優有效濃度，0.005～0.500 mg/L為NAA的合理有效濃度［19］。6-BA低濃度最適于促進腋芽的增殖，高濃度則會抑制腋芽生長發育。NAA的濃度高低會影響芽增殖速度，NAA濃度在0.1 mg/L以上時，腋芽增殖率會明顯降低［20］。其次，腋芽的增殖還會受環境因子、糖濃度、pH等多項因子的影響。莫磊興等［18］研究發現，隨著光照強度的提高，玻璃化的現象慢慢減緩，光照在3 000 lx左右腋芽的增殖培養率會得到有效提高。培養基的糖濃度與pH高低影響繼代的生長周期，因此，月季培養基中的糖含量不得超過50 g/L，pH必須低于5.5。

生根培養通常采用1/2 MS培養基。Hyndman等［21］認為，MS培養基中的氮鹽比與無機鹽相同，但高濃度氮鹽對生根有抑制作用，生根主要利用NAA、IBA、IAA等生長素，且NAA常用有效濃度為0.01～1.00 mg/L，IBA有效濃度為0.01～1.00mg/L，IAA使用則相對較少。李正平［22］將ATB用于月季組織培養的研究，發現生根的有效濃度為0.5～10.0 mg/L，生根的較佳濃度為0.5～2.0 mg/L。何松林等［23］將IBA、IAA和NAA添加在薩蔓莎生根培養基中，結果證明3種激素均能促進生根，且效果最佳的配方是：1/2 MS＋IBA 0.5 mg/L、1/2 MS＋IAA 1.0 mg/L與1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L。另外，在培養基中加入適量的活性炭能有效吸附有毒物質及沉淀。姚曉惠等［24］研究發現，月季組織培養的生根階段還受較多環境因子的影響，溫度為21℃時生根的長勢最好；且日光燈更適于月季的生根。

月季組培技術相對成熟，已有許多優良月季品種如卡羅拉、多情玫瑰、金太陽、芳純月季等多種研究對象及成果［25］，為月季快繁技術研究提供參考。本文在前人研究的基礎上，對豐花月季杏花村進行組培快繁試驗，使其具有優良遺傳特性和表型特性，同時縮短育種周期，以解決三亞地區月季育苗難問題，并建立適合三亞的月季組培育苗技術體系。

1 材料與方法

1.1 材料

外植體材料取自亞龍灣國際玫瑰谷，采健壯、芽點飽滿的杏花村枝條作為材料。試驗在三亞市南繁科學技術研究院的組培快繁實驗室及大棚中完成。

1.2 方法

1.2.1 外植體處理

外植體材料的處理：將采樣枝條進行2 h的流水沖洗，隨后分別將各芽點剪成5 cm左右莖段，莖段含1～2個芽點，外植體在超凈工作臺下用洗滌劑消毒2次。消毒：先用75%酒精浸泡3 min，用無菌水濕潤3次，再用0.1%氯化汞浸泡15 min，加一滴吐溫，輕輕攪拌，然后用無菌水潤洗5遍。消毒完畢，進行接種試驗，將消毒好的莖段處理至1 cm左右的長度，各個莖段都含有一個芽點，相接種至培養基中。

1.2.2 培養基設計

1.2.2.1 啟動誘導培養基

現選用WPM、MS、1/2 MS 3種培養基類型，添加0.5 mg/L的山農（外植體型）抑制污染，且每次選用30個芽節用于以下培養基進行水平正交試驗：（1） 空白對照；（2） WPM＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.05 mg/L；（3） WPM＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L；（4）WPM＋6-BA2.0mg/L＋NAA 0.2 mg/L；（5） 1/2 MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L；（6）1/2MS＋6-BA1.0mg/L＋NAA0.05mg/L；（7）1/2MS＋6-BA2.0mg/L＋NAA0.2mg/L；（8）MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L；（9）MS＋6-BA1.0mg/L＋NAA0.1mg/L；（10）MS＋6-BA2.0mg/L＋NAA0.05mg/L。

1.2.2.2 腋芽增殖培養基

將誘導長出的健壯新芽莖段通過無菌操作進行切割，接種到增殖培養基中進行培養。選用WPM培養基，添加6-BA、NAA、GA3和IBA四種植物生長激素，進行水平正交試驗，每次接種30株新芽，且添加0.5 mL/L山農（外植體型）抑制污染。（1）空白對照；（2） WPM＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L；（3） WPM＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.02 mg/L；（4）WPM＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L；（5） WPM＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L；（6） WPM＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.02 mg/L＋GA30.5 mg/L； （7）WPM＋6-BA 2.0 mg/L＋IBA 0.02 mg/L；（8） WPM＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L＋GA30.05 mg/L；（9）WPM＋6-BA 1.0 mg/L＋IBA 0.2 mg/L。

1.2.2.3 生根培養基

采用WPM培養基，添加NAA、GA3、IBA三種植物生長激素，以及0.5 mL/L山農（內生菌型）抑制污染，和0.1 g/L ACO誘導根系生長。設計水平正交試驗，每次試驗使用30株增殖獲得的健壯無根苗。（1）空白對照；（2）WPM＋NAA 0.1 mg/L＋IBA 0.1 mg/L；（3） WPM＋ NAA 0.2 mg/L＋ IBA 0.2 mg/L；（4） WPM＋GA30.1 mg/L＋NAA 0.05 mg/L＋IBA 0.1 mg/L；（5） WPM＋ GA30.1 mg/L＋ NAA 0.1 mg/L；（6）WPM＋ GA30.1 mg/L＋NAA 0.2 mg/L＋IBA 0.2 mg/L；（7） WPM＋ GA30.5 mg/L＋NAA 0.05 mg/L＋ IBA 0.2 mg/L；（8）WPM＋ GA30.5 mg/L＋ NAA 0.1 mg/L＋IBA 0.1 mg/L；（9） WPM＋ GA30.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L；

1.2.2.4 煉苗移栽

將生根培養基中生長健壯并且根部發育良好的組培苗，從無菌培養室轉移至溫室大棚，進行為期一周煉苗。一周后打開培養瓶瓶蓋，將組培苗取出用500～600倍的多菌靈溶液浸泡10 min，且洗凈根部殘留的培養基。然后放在陰涼通風處靜置晾干3～5 min，再移栽至蛭石中觀察15 d，記錄其生長過程及成活率［15］。

1.2.3 數據處理

用Excel 2010進行數據歸納整理，用SPSS 16.0統計軟件對記錄的數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同培養基組合對杏花村腋芽誘導的影響

從表1的正交試驗可知，不同植物生長素濃度配比對杏花村月季初代誘導培養的各處理間差異顯著。結果表明，生長調節劑對腋芽的誘導有一定的作用。其中WPM＋6-BA 1.0＋NAA 0.1 mg/L效果最為顯著。當6-BA濃度為1.0 mg/L，NAA濃度為0.1 mg/L時，葉片綠而健壯無愈傷，生長良好，誘導率較高，而外植體在無任何生長調節劑的WPM培養基中，雖能夠誘導腋芽發芽，但生長狀況一般，芽個數較少、誘導率較低。當培養基配方中的6-BA濃度為2.0和0.5 mg/L，NAA濃度為0.2和0.05 mg/L時，雖誘導腋芽的生長，但是植株生長狀況一般，葉黃較多，生長勢弱，說明在誘導培養階段生長調節劑的濃度過高或過低，不僅不利于腋芽分化，還可能抑制植株的正常生長，使葉片變黃。3種培養基類型中MS培養基最適宜植株生長，植株生長狀況較好，葉綠，高大健壯，但芽苗個數較少，誘導率較低。月季品種間的基因型各異和培養基配方有差異，不同濃度的生長調節劑組合對月季的腋芽誘導起不同作用。根據誘導的平均芽數和生長狀況來看，WPM＋6-BA1.0mg/L＋NAA 0.1 mg/L是杏花村腋芽誘導的最適培養基（圖1）。

圖1 腋芽誘導培養的生長發育過程

表1 不同培養基組合腋芽誘導的影響

2.2 不同培養基組合對杏花村腋芽增殖的影響

由表2可看出，杏花村月季的腋芽增殖效果差異顯著。WPM＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.02 mg/L的增殖效果較好，增殖率顯著高于其他處理，植株長得好，葉綠，產生的愈傷較少，成活率高。而腋芽在無任何生長調節劑的WPM培養基中，雖然能增殖，但生長比較差，葉黃，成活率極低。6-BA＋NAA＋GA3處理增殖效果較6-BA＋NAA和6-BA＋IBA差，葉黃，愈傷多，成活率低。結合芽的增殖率、成活率和生長狀況看，WPM＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.02 mg/L為最適合的腋芽增殖培養基（圖2）。

圖2 腋芽增殖培養的生長發育過程

表2 不同培養基組合腋芽增殖的影響

2.3 不同培養基組合對杏花村腋芽生根的影響

由表3可以看出，不同濃度的激素配比對杏花村月季的腋芽生根效果的差異顯著。其中WPM＋GA30＋NAA 0.2 mg/L＋IBA 0.2 mg/L，培養配方的效果最為顯著。從方差分析情況看，當IBA濃度為0.2 mg/L、NAA濃度為0.02 mg/L時，腋芽的平均根數為2.05根，平均株高為0.68 cm。相比其他處理，腋芽生長良好，葉片翠綠，高大健壯，根系發達，成活率高。而腋芽在無任何生長調節劑的WPM培養基中，雖可以達到生根的效果，但生長一般，較健壯，葉較綠，根系較發達。而WPM＋GA30.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L＋IBA 0.1 mg/L植株生長狀況較差，生長勢弱，葉黃，根系不發達，大面積死亡成活率低。根據腋芽的平均株高、平均根數、成活率和生長狀況來看，最適合腋芽生根培養的培養基為WPM＋NAA0.2mg/L＋IBA0.2mg/L（圖3）。

表3 不同培養基組合腋芽生根的影響

圖3 腋芽生根培養的生長發育過程

2.4 組培苗馴化成活率

以蛭石為基質，組培苗放在室外培養，隨著時間的變化，適應生長環境的植株，將會長出新葉，葉片數為2～3片，后期生長健壯會長出叢生芽，生長勢較弱的植株會慢慢表現出葉片枯黃，根部發黑。煉苗一周后，成活率為90%左右；煉苗兩周后，成活率為70%左右。說明豐花月季杏花村組培苗在三亞移栽馴化具有可行性。

3 討論與結論

本試驗研究了不同植物生長調節劑組合對豐花月季杏花村的腋芽誘導、增殖以及生根的影響。外植體的消毒處理與無菌操作在組培試驗中尤為重要，與吳林森等［26］提出的觀點相同。本試驗在外植體的消毒階段，另使用了山農試劑對枝條中存在的細小毛刺進行消毒處理，可更大程度上抑制污染發生。

在試驗中，發現MS培養基最適宜植株生長發育，與閆海霞等［27］研究認為WPM最適宜植株生長的觀點不一致。結果表明，WPM誘導時間相對MS要慢一些，植株的健壯程度相比MS稍差，但WPM的誘導率相對于MS誘導率更高。因此，腋芽的誘導選用MS培養基也可行。進行腋芽的誘導時，添加2 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA，會在一定程度上使植物葉片枯黃且長勢弱；將6-BA濃度調為1 mg/L、NAA濃度調為0.1 mg/L時，腋芽的誘導生長最佳。由此可見，試驗中的生長調節劑6-BA與NAA的有效濃度范圍與 Rout［16］和 Bressan［11］的研究相符。增殖階段中使用GA3效果并不理想，植株生長狀況差，死亡多，葉片黃，愈傷多；IBA則對腋芽的增殖有一定的促進效果。由此可見，進行月季腋芽的增殖時，GA3并不適合，IBA則可行，但相比而言，使用低濃度的6-BA和NAA更適于月季腋芽的增殖。在生根階段由于發生溫度變高導致根部變黑的情況，從而影響植株的正常生長。這與姚曉惠等［24］研究發現的結果一致，生根階段受溫度變化的影響較為顯著，其最適溫度為21℃。因此，本試驗中，將溫度控制在20～25℃，從而避免溫度變化的影響。最后進行移栽培養時，經多次反復移栽觀察后，豐花月季杏花村組培苗在蛭石基質中生長良好，成活率明顯較高。

綜上所述，豐花月季杏花村最適宜腋芽誘導的培養基為WPM＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L；最適合腋芽增殖培養的培養基為WPM＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.02 mg/L；最適宜生根的培養基為WPM＋NAA 0.2 mg/L＋IBA 0.2 mg/L；組培苗馴化以蛭石為基質，在室外培養觀察15 d，存活率為50%。