海南黑山羊GH1基因SNPs篩選及其與生長性狀的關聯性分析

管凇 周漢林 徐鐵山 孫衛平 胡海超

(中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所 海南?？?571101)

海南黑山羊是海南唯一的地方優良山羊品種，在海南各市、縣均有分布，但是，生長緩慢，繁殖力低，個體小，產肉性能低，出欄率低，市場供不應求，缺口大，嚴重影響海南黑山羊的產業化和規模化發展。海南黑山羊經濟性狀多受遺傳因素的影響。目前，針對海南養羊業發展現狀，擴大群體數量，保護黑山羊優良的遺傳基因的同時，培育出高產又具海南特色的黑山羊新品種，進一步提高品種生產性能、產肉性能和繁殖性能，推動海南養羊業規?；?、產業化發展勢在必行。因此，通過分子手段對海南黑山羊生長性狀的遺傳基礎進行解析，可以為海南黑山羊的分子育種提供一定的參考依據。

根據研究表明，生長激素1基因（GH1）可能是導致個體矮小的基因，為2.54 kb，由5個外顯子和4個內含子組成［1］，是控制哺乳動物的新陳代謝和生長性狀的基因。山羊GH1基因的遺傳多態性已經報道［1-2］，其他牲畜物種也有研究［3-6］。在埃及和沙特山羊［1］和中國波爾山羊［2］群體中發現GH1多態現象與生長性狀有關。Wickramaratne等［7］提出，GH1基因可用于生長性能的標記輔助選擇。在南非山羊品種內和品種間存在GH1的遺傳多樣性，在外顯子2和5處觀察到導致氨基酸變化的突變［8］。

本研究對海南黑山羊GH1基因編碼區進行SNPs篩選，并與生長性狀進行關聯性分析，旨在篩選可能影響海南黑山羊生長性狀的分子標記突變位點，也為應用標記輔助選擇改良山羊生長等重要經濟性狀提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

海南黑山羊來自中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所山羊保種場。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集和DNA處理

對104只成年山羊的體長、體高、體重進行測量。剪取耳組織，置于裝有75%乙醇的離心管中，4℃保存。采用DNA提取試劑盒提取耳組織總DNA，用紫外分光光度計檢驗每個樣品DNA質量濃度。

1.2.2 引物設計

從NCBI數據庫中查詢山羊GH1基因DNA序列（GenBank登錄號：NC_030826），根據單核苷酸多態性位點的序列信息，利用引物設計軟件Primer Plex 2設計引物，使用primer3plus在線設計單堿基延伸引物，引物信息見表1。

表1 引物信息

1.2.3 SNP位點的篩選和分型

對提取的DNA基因組序列進行擴增，PCR擴增反應總體積為 10 μL：5 μL 5×TaqPCRmastermix，上下游引物各0.5 μL（20 μmol/L），模板DNA 1 μL（20ng/μL），加ddH2O至10μL。PCR擴增程序：94℃預變性5 min；40個循環 （94℃ 20 s，60℃ 30 s，72℃30 min）；72℃再延伸3 min。將PCR產物去除體系中游離的dNTPs，再進行單堿基延伸反應，反應體系總體積5 μL。PCR產物委托武漢天一輝遠生物科技有限公司采用SnaPshot方法，用Gene marker分析得到的.fsa結果，導出峰圖及表格文件，并統計出每個樣品的SNP位點的基因型。

1.2.4 數據分析

利用Popgene 32（version 3.2）軟件和PICCALC程序對SNPs位點的分型結果進行處理，計算遺傳參數信息。采用SPSS 2.0軟件X2檢驗對群體中各SNPs位點的基因型頻率和等位基因頻率進行差異顯著性檢驗，從而與生長性狀（體長、體高、體重）性狀進行關聯分析。

2 結果與分析

2.1 SNPs位點在群體中的遺傳參數分析

10個SNPs位點中有4個錯義突變，6個為同義突變，錯義突變位點分別是Exon1-350G→A（G31S）、Exon2-739G→A（G85S），Exon3-1101A→G（D129G）、Exon3-1154C→T（R147W）。多態信息含量（PIC）是衡量基因變異程度的指標，當PIC＞0.5時，屬于高度變異多態；當0.25＜PIC＜0.5時，屬于中度變異多態；當PIC＜0.25是屬于低度多態變異。10個SNPs位點在海南黑山羊群體中所統計分析得出的遺傳參數值見表2，有9個SNPs位點都屬于中度多態位點，一個位點處于低度多態，9個位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態（p＞0.05），一個位點沒有檢測到P值，見表2。

表2 GH1基因上的10個SNPs位點的遺傳參數分析

2.2 不同SNP位點與性狀關聯分析

利用SPSS軟件統計各基因的不同SNP對應的表型（體長、體高和體重）的平均值及標準誤差，詳細結果見表3。利用SPSS中的一般線性模型對各基因的SNPs位點與表型進行關聯分析，GH1基因外顯子1、2、3、4檢測到10個SNPs位點，每個位點均只有2種基因型。一般線性模型的主體間效應檢測結果顯示，所有SNP位點基因型與表型（體長，體高和體重）均未有顯著差異。

表3 突變位點與生長性狀的關聯性分析

3 討論

動物的生長性狀是一種復雜的數量性狀，個體大小由遺傳、環境、飼養條件等因素相互作用而決定。對這些復雜的數量性狀來說，單基因的突變、關聯基因上的SNP變化是引起個體大小差別的遺傳基礎［9］。SNP是畜禽DNA序列中最常見的一種突變形式，其對性狀的功能和作用機制解析是當前基因組學研究的熱點之一。GH1基因屬于矮小基因。GH1基因是IGHD（特發性生長激素缺乏癥）中研究最深入的基因［10］。GH1基因突變患者表現為GH缺乏或減少，GH功能嚴重喪失，表現身材矮小、生長遲緩、骨骼成熟延遲［11］。Curi等［12］研究結果顯示，GH1基因多態性的ll基因型與牛屠宰時的增重和體重顯著相關。Cheng等［13］研究揭示，GH1基因的多態性與豬體重明顯相關。Pal等［14］研究表明，GH1基因的突變影響蛋白質結構的穩定性，導致雜交牛的生長，繁殖和產奶量減少。本研究對檢測到的海南黑山羊GH1基因的10個SNPs位點，其基因型與生長性狀（體長、體高、體重）關聯性分析顯示，差異并不顯著，可能與檢測樣本數量和群體分布有一定關系，本實驗采集的樣本來自本所種羊的一個保種場，長期圈養、近交等因素導致群體性狀趨于一致。