艾葉揮發性成分對膝骨關節病作用機制的網絡藥理學探討

王春柳 萬兆新 周潔 劉洋 張紅 李曄 蘇同生

摘要 目的：基于網絡藥理學方法探討艾葉揮發性成分對膝骨關節病的作用機制。方法：基于中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）、DrugBank、TTD數據庫分別建立艾葉揮發性成分-靶點網絡和疾病靶點網絡，基于Cytoscape 3.7.0軟件建立艾葉揮發性成分-作用靶點網絡并進行網絡拓撲屬性分析;利用DAVID數據庫對核心作用靶點進行基因本體（GO）功能富集分析和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。結果：構建的有效成分-作用靶點網絡有40個有效成分、265個靶點。靶點互做分析得到的核心靶點生物功能注釋分析，得到的核心BP過程包括類固醇代謝、膽汁酸和膽鹽運輸、氧化還原等;CC過程包括突觸后膜、原生質膜組成、等離子體膜等;MF過程包括血紅素結合、細胞外配體門控離子通道活性、類固醇羥化酶活性等。通路富集得到的核心KEGG通路包括神經配體受體交互作用通路、甾類激素生物合成、膽汁分泌等。網絡分析得到重要的活性成分有龍腦、杜松樟腦、異澤蘭黃素等。結論：艾葉揮發性成分對膝骨關節病的作用可能是基于調控神經配體受體交互作用通路、神經信號負傳導Toll樣受體信號等通路調理膝骨關節病。

關鍵詞 艾葉;網絡藥理學;揮發油;膝骨關節病;作用機制

Abstract Objective：The aim of this study was to investigate the mechanism of volatile components of artemisia argyi on knee arthropathy based on network pharmacology.Methods：The volatile component-target network and the disease target network of artemisia argyi were established respectively based on TCMSP，DrugBank and TTD databases.Core targets were enriched by DAVID database for gene ontology（GO） function and genome encyclopedia（KEGG） pathway.Results：The active component-action target network consisted of 40 active components and 265 targets.The annotation analysis of the biological function of the core target obtained by the analysis of the target interaction，the core BP process obtained included steroid metabolism，bile acid and bile salt transport，REDOX，inflammatory response，steroid hormone-mediated signaling pathway，etc.CC process included postsynaptic membrane，protoplasmic membrane composition，plasma membrane，organelle membrane，chlorine channel，etc.The MF process includes heme binding，extracellular ligand gated ion channel activity，steroid hydroxylase activity，iron ion binding，steroid binding，etc.The core KEGG pathways enriched by pathway include the neural ligand receptor interaction pathway，steroid hormone biosynthesis，bile secretion，cytochrome P450 metabolic response to exogenous drugs，negative neural signaling pathway，toll-like receptor signaling pathway，etc.The important active ingredients Predicted were borneol，juniper camphor，isoselanflavin，isoselanol，eugenol，eucalyptus olefine，spartanol，ter-turpentine，-pinene，-borneol acetate，cream-carytene，limonene，cur-elemene and cypreslidene.Conclusion：The effect of volatile components of artemisia argyi on knee arthropathy may be based on the regulation of the neural ligand receptor interaction pathway and the negative conduction of toll-like receptor signaling pathways.The pharmacodynamics may be closely related to borneol，juniper camphor，isoselanthin，isoselanol，eugenol and eucalyptus oil.

Keywords Moxa leaf; Network pharmacology; Volatile oil; Knee arthropathy; Pharmacological mechanism

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.003

膝骨關節病是因膝關節產生退行性改變導致關節內部功能發生障礙的一種慢性疾病，主要臨床表現是膝關節疼痛、活動受限、關節僵硬等，且兼具病程長、病情復雜等特點，嚴重降低患者生命質量[1-2]。

艾葉是菊科植物艾（Artemisia argyi Levl.et Van）的干燥葉。辛、苦、溫，歸肝、脾、腎經，具有“溫經止血、散寒止痛”的作用[3]。基于艾葉的溫通散寒作用，艾灸一直是臨床上治療膝骨性關節炎的常用療法，臨床報道療效良好，可明顯改善膝骨性關節炎患者疼痛、僵硬、功能障礙等臨床癥狀[4-6]。艾葉制劑如復方艾葉油乳膏也可減輕關節軟骨的病理損傷，治療膝關節骨關節炎的療效顯著。近年來，隨著艾灸療法的廣泛應用，艾煙帶來的環境污染和毒性問題也引起了普遍關注，長期高濃度的吸入艾煙對機體具有一定程度損傷作用[7-8]。由此，艾葉、艾灸的物質基礎和作用機制研究成為了研究者們必須首先探究明確的問題之一。

網絡藥理學是中藥學與計算科學、化學、藥理學、藥代動力學等多學科融合的一門交叉學科，其研究策略集化學成分-靶標-疾病-藥理作用網絡分析于一體，可以系統篩選中藥治療某一疾病的具體化學成分、可能作用靶點以及相關信號通路網絡，從而揭示藥物與靶標之間相互作用網絡的特點[9-11]。近年來網絡藥理學在中藥作用機制研究中逐漸發揮出越來越大的影響力。由此，本研究擬借助網絡藥理學方法分析艾葉揮發性成分對膝骨關節病作用機制，為艾葉在膝骨關節病中的臨床應用推廣和艾葉新型制劑開發奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 數據庫 采用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）;TTD數據庫（https：//db.idrblab.org/ttd/）;DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）;ETCM（http：//www.nrc.ac.cn：9090/ETCM/index.php/Home/Index/）;DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）;STRING數據庫（https：//string-db.org/，Version 10.5）;UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）;Cytoscape軟件（Version 3.4.0）。

1.2 艾葉揮發性成分收集 分別以艾葉揮發油為關鍵詞，查找國家知識基礎設施數據庫（簡稱中國知網，China National Knowledge Infrastructure，CNKI）、Web of Science數據庫、TCMSP，收集艾葉揮發油化學成分報道[12-19]。

1.3 艾葉揮發性活性化合物篩選 基于艾灸的用法，將艾灸視作經皮制劑處理，參考經皮制劑研究經驗報道[20]，以1

1.4 艾葉活性成分靶點集構建 利用TCMSP收集整理活性化合物作用靶點。

1.5 膝骨關節病靶點集構建 通過TCMSP[10]、Drug bank數據庫[11]、TTD數據庫[21]、ETCM數據庫[22]收集與膝關節病相關的作用靶點，將全部靶點信息導入UniProt數據庫轉換為Official Gene Symbol。

1.6 艾葉活性成分-作用靶點網絡構建與分析 利用STRING數據庫，查找艾葉揮發油成分-靶點對應的直接蛋白互作及疾病靶點蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡關系，分別導入Cytoscape 3.7.0中，構建艾葉揮發油化學成分-靶點PPI和膝關節病靶點PPI，利用Cytospace的Merge功能對上述2個PPI網絡進行合并，抽取交集網絡，即得活性成分-作用靶點網絡[23]。

1.7 基因功能富集分析與生物過程分析 利用DAVID數據庫對艾葉揮發油核心作用靶點進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

2 結果

2.1 活性化合物篩選 通過檢索中國知網數據庫中關于艾葉揮發性成分的報道，收集整理共得到71種化合物，經過對ALog P指標篩選，最后有40種成分符合要求。見表1。

2.2 活性成分靶點集構建 經TCMSP收集艾葉揮發性成分對應靶點，去重復后得到共計265個，由上述265個靶點組成靶點集合A。

2.3 膝骨關節病靶點集構建 將TCMSP數據庫、Drug bank數據庫、TTD數據庫、ETCM數據庫所收集到的膝骨關節病相關靶點匯集整理，去重復后得到共計265個，組成疾病靶點集合B。

2.4 活性成分-作用靶點網絡 經過交集計算，發現活性成分-靶點集合A與疾病靶點集合B的交集C共有10個靶點，分別為：ABCG2、CD86、CYP1A2、ESRRA、IL6、NOS2、PIK3CG、PLA2G1B、PTGS2、TP53。

PPI網絡經過Cytoscape 3.7.0可視化后見圖1。網絡拓撲分析可知活性成分-作用靶點網絡共計包含371個節點、137 270條成分-靶點作用關系，每個靶點平均相鄰靶點數目為28.943個，網絡中心度為0.345，上述數據可知，該網絡是個高度復雜、高密度網絡。

為了能夠進一步分析出上述網絡中的核心靶點作用集，運用Cytoscape的MCODE工具，進行核心網絡計算，設定自由度閾值為100，節點打分閾值為0.2，K值為2，最大深度為100，經計算得到2個最核心的子網絡集合。見圖2-A、圖3-A。經過比較發現，子網絡1中包含所有集合C中的靶點。子網絡2中，有交集C中的TP53、IL6靶點也在其中。對2個子網絡進行網絡拓撲分析，發現子網絡1包含346個節點119 370條對應關系，每個節點相鄰靶點數目為24.012，網絡中心度為0.456。子網絡2包含10個節點，分別為AKT1、TP53、TNF、IL6、STAT3、IL1B、IL10、CXCL8、VEGFA、ALB，每個節點平均相鄰靶點數為9個，網絡中心度為1.0。說明上述10個靶點為關鍵的樞紐靶點。

歸屬出子網絡1和子網絡2中靶點對應的活性成分，建立活性成分-靶點映射網絡分別見圖2-B、圖3-B。由圖2-B可知，按照度值排序，子網絡1對應活性成分前10位主要有：龍腦、異澤蘭黃素、杜松樟腦、異龍腦、丁香酚、桉油精、斯巴醇、α-松油烯、β-蒎烯、（-）-乙酸龍腦酯，另外β-石竹烯、檸檬烯、γ-欖香烯、柏木烯等成分也同樣屬于網絡核心節點，表明其活性與膝骨關節病相關。由圖3-B可知，按照度值排序，子網絡2對應活性成分前10位主要有：龍腦、杜松樟腦、異龍腦、α-松油烯、氧化石竹烯、α-松油烯、斯巴醇、桉油精、β-蒎烯、（-）-乙酸龍腦酯。

2.5 基因功能富集分析與生物過程分析 將該核心網絡中靶點列表導入DAVID進行功能富集分析，子網絡1和子網絡2的GO和KEGG分析結果分別見圖4、圖5。

由圖4可知，按照P值排名，核心靶點子網絡1中靶點主要參與生物過程（Biological Process，BP）前10位包括藥物反應、類固醇代謝、膽汁酸和膽鹽運輸、氧化還原、異型生物質的代謝、P450酶、炎癥反應、類固醇激素介導的信號通路、藥物代謝;主要參與的細胞組分（Cellular Component，CC）涉及突觸后膜、原生質膜組成、等離子體膜、細胞器膜、氯通道、細胞緊密連接、細胞表面性質、管基底等離子體膜;參與的分子功能（Molecular Function，MF）包括血紅素結合、細胞外配體門控離子通道活性、類固醇羥化酶活性、鐵離子結合、類固醇連接、氧化還原酶活性、供體受體配對、分子氧結合或還原、類固醇激素受體活性、藥物連接、單氧酶活性等等。

核心靶點子網絡2雖然包含靶點較少，依然涉及大量核心的生物過程，同樣按照顯著性P值排名，其參與的BP前10位包括凋亡過程負調控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、基因表達的正調控、序列特異性DNA結合轉錄因子活性的正向調控、炎癥反應、細胞增殖的負調控、一氧化氮生物合成過程的正調控、轉錄的正調控、DNA模板化、細胞對有機環化合物的反應、肽酰絲氨酸磷酸化的正調控等;主要參與的CC涉及細胞外區域、蛋白質復合體、血小板-阿爾法顆粒管腔、分泌顆粒、細胞質、核染色質等;參與的MF包括細胞因子活性、相同的蛋白結合、生長因子活性、轉錄調節區DNA結合、蛋白磷酸酶2A結合、蛋白結合、銅離子結合、蛋白磷酸酶綁定、伴侶蛋白綁定、轉錄激活子活性、RNA聚合酶Ⅱ轉錄調控區序列特異性結合等。

由圖5-A可知，核心靶點子網絡1中靶點主要富集的通路過程（前10位）代表性的有汁分泌、細胞色素P450對外源性藥物代謝反應、神經信號負傳導神經配體受體交互作用通路、甾類激素生物合成、膽通路等;由圖5-B可知，核心靶點子網絡2主要富集的前10位代表性通路有類風濕性關節炎、Toll樣受體信號通路等。

3 討論

艾灸是中醫學的瑰寶之一，守正創新，傳承精華，開展艾灸作用機制研究是其重要內容之一。但是，艾灸療法不同于傳統的湯藥等內服中藥，其臨床使用方式是用艾絨在體表的穴位上燒灼、溫熨，借灸火的熱力以及藥物的作用，通過經絡的傳導，以起到溫通氣血、扶正祛邪，從而防治疾病。由于給藥方式的特殊性，有關艾灸的藥理研究尚待深入開展，因此，找到一種可靠方法能夠為動物實驗或臨床試驗開展指定方向，將具有重大的應用價值[6]。本研究首次基于網絡藥理學方法，對艾灸的典型臨床應用—膝骨關節病中艾灸的作用機制進行了初步分析，也可為后續其他疾病中分析應用提供方法學參考借鑒。

《中華人民共和國藥典》2015版本中對于艾葉的質量控制檢查項還只有水分和總灰分2項，含量測定僅限于對桉油精單成分的測定。隨著臨床及家用艾灸需求的增加，對于艾葉的質量控制也將提出新的要求，艾葉中新的質控成分還需要繼續挖掘。本研究從成分藥理活性角度給出了龍腦、杜松樟腦、異澤蘭黃素、異龍腦、丁香酚、斯巴醇、α-松油烯、β-蒎烯、（-）-乙酸龍腦酯、β-石竹烯、檸檬烯、γ-欖香烯、柏木烯等成分作為潛在質控指標的依據，但還需要結合含量測定及艾葉整體指紋圖譜等分析結果，作為研究新的艾葉質量控制標準的依據。

本研究采用網絡藥理學分析，發現艾葉揮發性成分可能是通過調控神經配體受體交互作用通路、甾類激素生物合成、膽汁分泌、細胞色素P450對外源性藥物代謝反應、神經信號負傳導Toll樣受體信號通路等治療膝骨關節病。藥效作用與龍腦、杜松樟腦、異澤蘭黃素、異龍腦、丁香酚、桉油精、斯巴醇、α-松油烯、β-蒎烯、（-）-乙酸龍腦酯、β-石竹烯、檸檬烯、γ-欖香烯、柏木烯等成分密切相關，本研究分析結果可為艾灸在膝骨關節病中臨床應用提供理論依據，為后續進行艾灸治療膝骨關節病作用機制和有效成分尋找及質量控制研究提供線索，具體機制還有待進一步的實驗驗證。

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（2020-09-24收稿 責任編輯：魏慶雙，徐穎）