中藥單體減輕對乙酰氨基酚誘導肝損傷的研究

陳 玲，龔先瓊

（1.福建中醫(yī)藥大學，福建 福州 351012；2.福建中醫(yī)藥大學附屬廈門中醫(yī)院肝病中心，福建 廈門 361009）

對乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）是一種世界范圍內(nèi)廣泛使用的解熱鎮(zhèn)痛藥，在治療劑量內(nèi)是安全的，過量使用可導致嚴重的肝損傷。APAP 是一種劑量依賴型肝損傷藥物，APAP 過量是西方國家藥物性肝損傷最常見的原因，半數(shù)以上急性肝衰竭病例是由APAP 過量引起的[1]。N-乙酰半胱氨酸（Nacetylcysteine，NAC）是目前唯一臨床上被批準的治療APAP 中毒的解毒劑，其通過促進谷胱甘肽（glutathione，GSH）合成發(fā)揮作用，可將APAP 過量的死亡率降低20%～28%[2]。但是NAC 發(fā)揮作用較為局限，其有效性僅限于早期階段，且對干預的時間有嚴格要求，所以尋找新的治療方法或藥物成為迫切的需要。中藥作為天然藥物，具有治療范圍廣，毒副反應小等優(yōu)勢，為治療藥物性肝損傷提供了新的思路，本文將對中藥單體減輕APAP 誘導肝損傷的相關研究作一綜述。

1 APAP 在肝內(nèi)轉(zhuǎn)化成有毒的代謝產(chǎn)物

APAP 進入肝臟后，90%在UDP-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶和硫酸基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下經(jīng)葡糖醛酸化和硫酸化途徑形成無毒代謝物，后經(jīng)膽道和腎臟排出體外，10%的藥物在細胞色素P450 酶，特別是CYP2E1 的作用下，轉(zhuǎn)化為一種能與巰基結(jié)合的高毒性的反應性中間體N-乙酰基-對-苯醌亞胺（NAcetyl-p-benzoquinone imine，NAPQI）。正常情況下，NAPQI 可以與GSH 結(jié)合而被解毒[3]。隨著APAP 過量，葡萄糖醛酸化和硫酸化途徑變得飽和，產(chǎn)生過量的NAPQI，消耗GSH 儲備，導致NAPQI 積累，通過半胱氨酸殘基與線粒體蛋白發(fā)生共價結(jié)合形成APAP 蛋白加合物[4]。APAP 誘導的肝毒性是由NAPQI直接引起的，但隨后的基因調(diào)控會加重肝臟毒性，涉及代謝障礙、氧化應激和炎癥反應調(diào)節(jié)等多個途徑。

2 APAP 誘發(fā)肝損傷的作用機制

2.1 線粒體的結(jié)構和功能損傷 線粒體是真核生物進行氧化代謝產(chǎn)生能量的場所，也是APAP 代謝場所，NAPQI 的作用位點。過量的NAPQI 與線粒體膜蛋白共價結(jié)合形成的蛋白加合物，破壞了線粒體膜結(jié)構，使線粒體膜通透性增加及電位改變，干擾線粒體電子傳遞鏈，導致電子從線粒體逃逸。同時，NAPQI 也可以與ATP 合酶α 亞基結(jié)合抑制ATP 合成。另一方面，GSH 的耗竭使線粒體內(nèi)氧化機制失衡，產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）、氧化線粒體DNA（mitochondria DNA，mtDNA），進一步激活人體免疫系統(tǒng)釋放核酸內(nèi)切酶G（endonuclease G，Endo G），并轉(zhuǎn)移至核內(nèi)使DNA 碎片化[5，6]。最終使線粒體結(jié)構和功能破壞共同導致細胞的壞死。

2.2 氧化應激 研究表明[4]，APAP 引起的肝損傷與c-jun N 末端蛋白激酶（c-JunN-terminalproteinkinase，JNK）的持續(xù)激活，并移位至線粒體放大線粒體的氧化應激機制密切相關。來自電子傳遞鏈的逃逸電子與氧反應形成超氧陰離子（O2-），進一步歧化生成H2O2，或與NO 發(fā)生反應形成過氧亞硝基，是一種強氧化劑，H2O2和過氧亞硝酸鹽的過量均可能使抗氧化防御系統(tǒng)崩潰。另一方面，H2O2可啟動凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1 的自我激活，進而激活JNK，p-JNK 易位至線粒體并與SH3 同源相關的BTK 結(jié)合蛋白結(jié)合使其磷酸化，這種相互作用導致線粒體內(nèi)Src 失活，導致電子傳遞鏈功能障礙，導致ROS 釋放，后者通過上游絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinases，MAPK）途徑再次激活JNK，JNK 的持續(xù)激活放大線粒體活性氧，形成一個自我維持的激活環(huán)[7，8]。

2.3 炎癥反應 急性炎癥反應是“二次打擊”過程中第二次打擊發(fā)生的原因，Toll-樣受體（toll-like receptors，TLRs）是觸發(fā)APAP 晚期肝毒性的直接因素，其在激活先天免疫系統(tǒng)中起著主導作用[9]。TLR是損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）的重要調(diào)節(jié)因子，能夠識別組織損傷過程中的應激或死亡細胞釋放。研究表明[10]，在APAP 引發(fā)的肝損傷中，Toll-樣受體4（toll-like receptors 4，TLR4）表達增加，激活核因子（NF-κB）信號傳導途徑，進而促進NF-κB 通路介導的炎癥因子和炎癥介質(zhì)（TNF-α、IL-1β 和IL-6）的產(chǎn)生，最終導致肝損害加重。

2.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及細胞凋亡 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是APAP引發(fā)肝損傷過程中的晚期效應，張謝等[11]的研究表明，APAP 過量代謝產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，可以提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路相關蛋白GRP78、PDI 等表達，并提高半胱天冬酶3（Caspase3）的活性，激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和細胞凋亡。細胞凋亡是急性肝功能衰竭的主要原因，APAP 可以上調(diào)促凋亡蛋白Bax 表達，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達，Bax 在細胞凋亡過程中轉(zhuǎn)移到線粒體，通過釋放細胞色素c 使線粒體膜通透性改變誘導細胞凋亡[10，12]。

3 減輕APAP 誘導肝損傷的中藥單體分類

3.1 苷類化合物

3.1.1 人參 味甘、微苦，有大補元氣、補脾益肺、養(yǎng)血生津、安神益智的功效。其主要活性成分人參皂苷（Ginsenoside，GS）具有抗腫瘤、抗疲勞、抗氧化、降糖等作用。在APAP 誘導的小鼠急性肝損傷動物模型實驗中，與APAP 模型組相比，人參皂苷Rg5（GRg5）預處理可以顯著抑制APAP 引起的肝細胞壞死、炎性細胞浸潤和凋亡等肝損傷，并可增加Bal-2蛋白表達，降低Bax 蛋白表達，表明G-Rg5 可能通過抑制細胞凋亡發(fā)揮抗APAP 誘導的肝毒性的肝臟保護作用[13]。在APAP 誘導急性肝損傷的體外實驗中，Ning C 等[14]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1（G-Rg1）通過激活核轉(zhuǎn)運因子（nuclear transport factor 2，Nrf2）信號通路發(fā)揮抗氧化作用，經(jīng)G-Rg1 處理后，增加了Nrf2 的蛋白表達水平，Nrf2 轉(zhuǎn)移到細胞核并與抗氧化反應原件（antioxidant response element，ARE）結(jié)合，上調(diào)其下游的抗氧化基因表達，包括GCLC、GCLM、NQO1 和HO-1 等，減少氧化損傷。故人參皂苷可通過抑制細胞凋亡或激活Nrf2 信號通路抗氧化發(fā)揮肝臟保護作用。

3.1.2 紅景天 味甘，有健脾益氣、清肺止咳等功效。其主要活性成分紅景天苷（salidroside，SALD）具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用。在C57BL/6 小鼠的體外實驗模型中，Western blot 結(jié)果提示APAP 模型組Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein1，Keap1）及Nrf2蛋白表達水平降低，進而抑制其下游抗氧化酶HO-1、NQO1 和GCLC 蛋白表達，破壞線粒體氧化應激機制，誘導肝損傷，而SALD 治療組中上述蛋白表達水平顯著升高，表明SALD 可能通過調(diào)控Keap1-Nrf2 信號通路發(fā)揮抗氧化作用來保護APAP 誘導的肝損傷[15]。正常情況下，Nrf2 與Keap1 偶聯(lián)存在于細胞質(zhì)中，當Nrf2 被激活進入細胞核，與ARE 結(jié)合而調(diào)節(jié)其下游基因表達，實現(xiàn)抗氧化能力[16]，表明紅景天苷可能是通過調(diào)控Keap1-Nrf2 信號通路減輕APAP 誘導的肝損傷。

3.1.3 梔子 味苦，有瀉火除煩，清熱利濕等功效。梔子苷（geniposide，GP）是從梔子果實中提取的一種環(huán)烯醚萜苷，具有抗炎的作用。Yang S 等[17]實驗結(jié)果表明，GP 預處理可顯著抑制TLR4 表達和NF-κB 激活，減輕TNF-α 和IL-1β 的釋放，從而證明，GP 可通過抑制TLR4/NF-κB 信號通路，有效保護肝細胞免受APAP 肝毒性作用。

3.1.4 桔梗 味苦、辛，有宣肺、祛痰等功效。桔梗皂苷（platycodon grandiflorum saponins，PGS）使其主要活性成分，具有抗腫瘤、抗炎的作用。在APAP 誘導小鼠急性肝損傷模型中，一方面，PGS 通過抑制NFκB 的mRNA 及蛋白表達，有效減少TNF-α、IL-1β的分泌；另一方面，PGS 激活AMPK，使磷脂酰肌醇激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）磷酸化，從而抑制Caspase3 的活性，降低凋亡級聯(lián)反應，證實了PGS通過激活AMPK/PI3K/Akt 信號通路和抑制NF-κB信號通路保護肝臟[18]。

3.2 多糖類化合物

3.2.1 桑葚 味甘、酸，有補肝益腎等功效。其提取物桑葚總多糖（MFP）具有抗炎的作用。研究表明，MFP劑量依賴性的改善了APAP 誘導的HepG2 細胞死亡；免疫印跡分析表明，相對于模型組，MFP 可明顯升高抗氧化酶HO-1 和G6PD 的蛋白表達。同時下調(diào)NF-κB 通路中NF-κB p65 蛋白表達水平，抑制其下游炎癥因子TNF-α，IL-1β 和IL-6 的轉(zhuǎn)錄，說明MFP 可以通過NF-κB 信號通路減輕APAP 誘導的肝臟毒性[19]。

3.2.2 茯苓 味甘、淡，有健脾行氣、利水滲濕的功效。主要活性成分茯苓多糖具有降糖、降壓等作用。在產(chǎn)前對乙酰氨基酚（300 mg/kg）誘導肝損傷胎鼠模型中觀察到，與模型組相比，經(jīng)茯苓多糖給藥后胎鼠肝細胞內(nèi)成纖維細胞生長因子21（FGF21）濃度明顯升高，有促進細胞增殖、修復的作用；另一方面，蛋白激酶B（AKT）磷酸化水平升高，抑制激活半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶系（caspases），證實茯苓多糖通過激活AKT 通路抗細胞凋亡[20]。

3.2.3 五味子 味酸、甘，有收斂固澀、補腎寧心等功效。其提取物五味子多糖（schisandra chinensis polysaccharide，SCP）具有抗氧化的作用。車金營等[21]研究表明，SCP 可以抑制JNK 磷酸化，降低GSH 的消耗水平；同時下調(diào)Bax、caspase-3 蛋白表達及升高Bcl-2 蛋白表達，證實SCP 通過調(diào)控JNK 信號通路及抑制細胞凋亡相關信號通路發(fā)揮肝保護作用。王瑤等[22]通過比較SCP 和五味子的另一種主要活性成分木脂素（SCL）對APAP 誘導小鼠急性肝損傷的保護作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在APAP 模型中SCP 的治療效果更顯著，主要通過調(diào)節(jié)Nrf2-NO-1 抗氧化通路，提高血清中相關酶（SOD、GST、HO-1）的含量發(fā)揮肝保護作用。綜上，五味子多糖可以通過抑制細胞凋亡通路或調(diào)控Nrf2-NO-1 抗氧化通路減輕APAP誘導的急性肝損傷。

3.2.4 當歸 味辛，有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛的功效。其提取物當歸多糖（angelica sinensis polysaccharide，ASP）具有抗氧化的作用。Cao P 等[23]發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)實驗中，H＆E 染色顯示ASP 減少了暴露于過量APAP的大鼠肝細胞的變性和細胞質(zhì)空泡化的數(shù)量，在體外試驗中，ASP 顯著提高了暴露于過量APAP 的大鼠原代肝細胞的存活率；進一步研究表明ASP 可增加GSH 含量，提高Bcl-2 蛋白表達和下調(diào)caspase-3、Bax 蛋白表達，提示ASP 通過改善氧化應激和抑制細胞凋亡相關信號通路減輕肝臟損傷。

3.3 其他類化合物

3.3.1 黃芩 味苦，有清熱燥濕，瀉火解毒的功效。其主要活性成分包括黃芩苷和黃芩素，具有抗氧化、護肝的作用[24]。Shi L 等[25]研究表明，黃芩苷和黃芩素可調(diào)節(jié)Nrf2 的激活，并增加其下游抗氧化基因的表達，同時也可誘導細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）1/2 和蛋白激酶C（PKC）的持續(xù)磷酸化，而ERK1/2 和PKC都是調(diào)節(jié)黃芩苷或黃芩素激活Nrf2 的關鍵，從而證明黃芩苷和黃芩素通過調(diào)節(jié)Nrf2 信號通路減輕APAP 誘導的肝毒性。

3.3.2 厚樸 味苦、辛，有燥濕消痰、下氣除滿的功效。其主要活性成分和厚樸酚（honokiol，HO）具有抗氧化的作用。Yu FL 等[26]研究表明，HO 可以促進Nrf2及其靶酶如GCLC，GCLM 和GST 的活化，引起GSH的表達上調(diào)，說明HO 通過激活Nrf2 信號通路減輕APAP 誘導的肝損傷。

3.3.3 荷葉 味苦，清暑化濕，升發(fā)清陽，涼血止血的功效，其提取物荷葉總生物堿（total alkaloids from lotus leaves，TAL）具有抗氧化作用。在APAP 誘導小鼠急性肝損傷模型中，與對照組相比，TAL 可以下調(diào)肝組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎癥因子的含量，提高肝組織中SOD、CAT、GSH-Px 等抗氧化酶的活性，表明TAL 可能通過提高機體抗氧化能力和激活AMPK/Nrf2 通路減輕APAP 誘發(fā)的急性肝損傷[27]。

4 總結(jié)

對乙酰氨基酚是目前引起藥物性肝損傷最常見的藥物之一，而NAC 作為唯一被批準的用于APAP過量的解毒劑，作用比較局限，其有效性僅限于早期階段。隨著中藥藥理研究的不斷深入，中藥治療藥物性肝損傷已顯現(xiàn)出多種優(yōu)勢。但由于中藥的多組分、多靶點及協(xié)同作用，未來在研究中藥減輕APAP 誘導肝損傷的具體分子機制仍具有極大的挑戰(zhàn)性，需要進一步明確中藥的每種單體的作用，以及各種單體之間的相互作用或協(xié)同作用。探討中藥單體治療APAP 誘導肝損傷具有現(xiàn)實意義，相信會成為未來研究的潛在熱點。