社區獲得性和醫院獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的差異

胡玥，劉心偉，張小倩，劉冬梅，李永偉

(河南省中醫院/河南中醫藥大學第二附屬醫院 檢驗中心，河南 鄭州 450002)

自1961年英國學者Jevons發現耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)以來，MRSA已成為院內感染的重要病原菌之一，因此也習慣被稱為醫院獲得性MRSA(hospital acquired MRSA，HA-MRSA)[1]。近年來，MRSA感染的流行病學發生了明顯的變化。有研究發現，在相當長的一段時間內，HA-MRSA的感染能相對保持穩定，但社區獲得性MRSA(community acquired MRSA，CA-MRSA)的感染卻在逐年增加，并超過HA-MRSA，成為常見的MRSA感染的病因，引起了全世界的廣泛關注[2]。因為一旦感染了MRSA，將對青霉素類、β內酰胺類復合藥物、頭孢烯類(具有抗MRSA活性的頭孢菌素除外)和碳青霉烯類藥物耐藥，給臨床治療帶來很大的困難。而Panton-Valentine殺白細胞素(Panton-Valentine leucocidin，PVL)基因被認為是MRSA發展成侵襲性感染的重要因素，因此也可能成為抗生素治療的潛在靶點。本文根據美國疾病預防控制中心對HA-MRSA和CA-MRSA的篩選標準，對河南省中醫院分離出的MRSA菌株進行初步篩選，并對二者的標本來源、耐藥性和PVL基因的攜帶情況進行分析，為MRSA發展成侵襲性感染的預防和精準治療提供實驗數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株來源 收集2015年1月至2018年12月河南省中醫院分離的214株耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌，依據美國疾病預防控制中心對CA-MRSA的篩選標準[2]進行篩選：(1)患者在門診或入院48 h之內分離到的MRSA菌株；(2)1 a內無住院或醫療機構接觸史；(3)無留置各種導管及其他穿透皮膚的醫用裝置。結合2001年衛生部頒布的《醫院感染診斷標準(試行)》進行診斷[3]，共篩選出116株CA-MRSA，98株HA-MRSA。所有菌株均采用VITEK2-Compact全自動微生物鑒定儀及相應的配套試劑進行鑒定和藥敏試驗。

1.1.2主要試劑與儀器 (1)試劑：VITEK2-Compact全自動微生物鑒定卡GP和藥敏卡GP67購自法國BioMérieux公司，哥倫比亞血平板、MH瓊脂平板購于安圖生物科技有限公司，頭孢西丁紙片購自英國Oxoid公司，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)Mix、DNA Marker、4s Red plus和瓊脂糖均購自上海生工生物工程有限公司。(2)儀器：基因擴增儀、電泳儀和凝膠成像儀均購自美國Bio-Rad公司，低溫高速離心機購自德國Eppendorf公司，潔凈工作臺購自濟南鑫貝西生物技術有限公司，恒溫水浴箱購自上海一恒科學儀器有限公司。

1.1.3質控菌株 質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923和ATCC29213，購自衛生部臨床檢驗中心。PVL基因陽性的金黃色葡萄球菌由同濟大學附屬上海市肺科醫院余方友教授惠贈，本實驗室保存。

1.2 操作方法

1.2.1菌株鑒定和藥敏試驗 采用法國生物梅里埃VITEK2-Compact全自動微生物鑒定和藥敏儀及配套的GP和GP67檢測卡進行細菌鑒定和藥敏試驗。對于MRSA菌株，用頭孢西丁紙片法進行復核。藥敏試驗的結果均根據當年最新的美國臨床和實驗室標準協會標準來判斷。

1.2.2MRSA菌株的篩選 根據美國臨床和實驗室標準協會對MRSA的定義(對苯唑西林耐藥的金黃色葡萄球菌稱為MRSA)進行篩選。

1.2.3CA-MRSA和HA-MRSA的篩選 根據美國疾病預防控制中心對CA-MRSA的篩選標準[2]和2001年衛生部頒布的《醫院感染診斷標準(試行)》進行初步篩選[3]。

1.2.4PVL基因篩選PVL基因引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，PVL基因的引物序列：PVL F為5’-ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGA-3’，PVL R為5’GCATCAATGTATTGGATAGCAAAAGC-3’。細菌基因組DNA提取使用上海生工Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒，操作按照說明書進行。反應體系為50 μL，其中Mix混合液25 μL，正向、反向引物各1 μL，模板1 μL，以ddH2O補足體積。擴增條件：預變性95 ℃，5 min，變性95 ℃，30 s，退火52 ℃，30 s，延伸72 ℃，60 s，持續35個循環，最后一步延伸，72 ℃，10 min，1%凝膠成像，拍照保存。

1.2.5數據分析方法 采用WHONET 5.6和SPSS 20.0統計軟件處理數據。定性資料CA-MRSA與HA-MRSA標本來源、構成比及PVL基因檢測差異的組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料2015年1月至2018年12月，河南省中醫院共分離出536株金黃色葡萄球菌，其中MRSA 214株，占40%。MRSA的標本來源中，膿液標本 66株(30.8%)，其次是痰液58株(27.1%)，耳分泌物42株(19.6%)，前列腺液15株(7.0%)，全血14株(6.5%)，肺泡灌洗液9株(4.2%)，引流液8株(3.7%)，尿液2株(0.9%)。

2.2 菌株來源差異分析在214株MRSA中，初步篩選出CA-MRSA 116株及HA-MRSA 98株。其中CA-MRSA主要來自于甲狀腺乳腺外科的化膿性乳腺炎、耳鼻喉科的化膿性中耳炎和泌尿系統的化膿性炎癥的膿液分泌物，HA-MRSA主要來自于下呼吸道感染和血流感染。二者標本來源的構成比比較，差異有統計學意義(P<0.001)。標本來源的區別見表1。

表1 CA-MRSA與HA-MRSA標本來源及構成比[n(%)]

2.3 CA-MRSA與HA-MRSA對常用抗菌藥物的耐藥性CA-MRSA與HA-MRSA對常用抗菌藥物的耐藥率見表2。從表中的數據可以看出，2種MRSA均對3種以上常用抗菌藥物耐藥。2種MRSA對萬古霉素、利奈唑胺、奎奴普丁/達福普汀、替加環素和呋喃妥因均100%敏感，對紅霉素、克林霉素的耐藥率均高于80%，CA-MRSA甚至達到了100%，但是CA-MRSA對環丙沙星、左氧氟沙星和慶大霉素的耐藥率低于HA-MRSA(P<0.05)。

表2 CA-MRSA與HA-MRSA對常用抗菌藥物耐藥率的比較(%)

2.4PVL基因擴增產物電泳結果本次試驗對116株CA-MRSA和98株HA-MRSA進行了PVL基因的檢測，部分擴增產物的電泳結果見圖1。PVL基因擴增產物長度為433 bp，條帶清晰，特異性好。116株CA-MRSA中，有85株攜帶PVL基因，占73.6%；98株HA-MRSA中，有25株攜帶PVL基因，占25.5%。CA-MRSA中PVL基因的攜帶率高于HA-MRSA，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 CA-MRSA與HA-MRSA PVL基因檢測差異比較

MRSA為耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌；PVL為Panton-Valentine殺白細胞素；PCR為聚合酶鏈反應。

圖1 部分PVL基因陽性MRSA PCR電泳圖

3 討論

抗菌藥物的大量使用導致耐藥細菌的檢出呈逐年上升趨勢，其中MRSA引發的耐藥問題尤為突出。在河南省中醫院2015—2018年分離出的214株MRSA菌株中，116株為CA-MRSA，占比54.2%，多來自耳鼻喉科和乳腺外科的皮膚軟組織感染， 98株為HA-MRSA，占比45.8%，多來自重癥醫學科和肺病科的呼吸系統感染和血流感染。CA-MRSA的檢出率高HA-MRSA將近10個百分點，且二者標本來源不同，說明二者引起的感染類型不同。就耐藥特點及用藥選擇而言，2種MRSA對紅霉素和克林霉素的耐藥率達80%以上，CA-MRSA甚至達到了100%，但對萬古霉素、利奈唑胺、奎奴普汀/達福普汀、替加環素和呋喃妥因100%敏感。因此，在治療由MRSA導致的全身嚴重性感染時，首選糖肽類藥物。二者耐藥特點的最大區別在慶大霉素和喹諾酮類藥物上，CA-MRSA的耐藥率遠低于HA-MRSA，這與國內外的相關報道一致[4-6]。本研究和全國細菌耐藥監測網(Chinese Antibiotic Resistance Surveillance System，CARSS)的耐藥數據一致，在耐藥性較弱的CA-MRSA的用藥選擇上，可以選用萬古霉素以外的藥物來治療，如氨基糖苷類或喹諾酮類藥物，以減少藥物的毒副作用。而美國感染病學會(Infectious Diseases Society of America，IDSA)目前推薦克林霉素、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、強力霉素或利奈唑胺類藥物經驗性治療疑似CA-MRSA皮膚和軟組織感染[7]，可減輕萬古霉素的選擇壓力，延緩萬古霉素非敏感菌株的出現。鑒于二者耐藥特點的差異，在用藥選擇上也應有所區別。對CA-MRSA引起的感染，可選用氨基糖苷類或喹諾酮類作為糖肽類的替代用藥，而對HA-MRSA引起的感染，糖肽類依然是首選。

MRSA可以大量分泌破壞宿主細胞的毒力因子，介導致病性和鈍性免疫防御。其中PVL被認為是MRSA發展成侵襲性感染的重要因素，是抗菌治療的潛在靶點[8]。PVL是一種可引起白細胞破壞和組織壞死的細胞毒素，屬于synergohymenotropic毒素家族，由lukS-PV和lukF-PV這兩個基因編碼共同轉錄。PVL以八聚體形式在宿主巨噬細胞、單核細胞和多形核細胞的細胞膜上形成孔道，損傷細胞膜，導致細胞溶解死亡和炎癥[9]。因此，PVL基因陽性金黃色葡萄球菌致病能力更強，可引起嚴重的組織壞死，易出現暴發性起病，病死率高。本研究針對2種MRSA的PVL基因檢測結果顯示，近80%的CA-MRSA都攜帶有PVL基因，而HA-MRSAPVL基因攜帶率不足30%，CA-MRSA菌株PVL基因的攜帶率高于HA-MRSA，這與目前國內外相關報道一致[10-11]。CA-MRSAPVL基因的高攜帶率使PVL基因曾一度被認為是CA-MRSA的標志性毒力基因，PVL基因在CA-MRSA所導致的皮膚和軟組織感染中起重要作用，與嚴重的社區獲得性壞死性肺炎密切相關[12]。近年來一些國家的研究報告也顯示，PVL基因陽性的CA-MRSA導致的感染呈上升趨勢，與當地MRSA的社區流行和醫院感染有關。而且，PVL基因陽性的CA-MRSA感染并引起并發癥如壞死性筋膜炎、肺炎、膿毒癥甚至死亡的發生率更高[13]。因此比較2種MRSA的PVL基因攜帶情況，尤其關注CA-MRSA的攜帶情況，對于預測是否易發展成侵襲性感染具有重要意義。對于PVL基因陽性的CA-MRSA，臨床應高度重視，不可因其耐藥性弱而掉以輕心，應進行早期干預，避免局部感染的擴散，減少并發癥的發生。

綜上所述，通過對CA-MRSA與HA-MRSA的感染部位、耐藥情況及PVL基因的攜帶情況進行實驗研究和回顧性分析，可更好地讓臨床醫生掌握河南省中醫院或本區域內的流行情況，更加重視PVL基因陽性的CA-MRSA，客觀評估其感染程度。PVL基因陽性的CA-MRSA更容易發展成嚴重的侵襲性感染，可能成為抗CA-MRSA治療的潛在靶點，為抗MRSA藥物的研發提供新的思路。另外在臨床工作或是社區醫療工作中，加強宣教，對于皮膚軟組織感染要引起足夠的重視，及時處理，避免發展成侵襲性感染。