3D打印絲素蛋白/聚乙烯醇/納米羥基磷灰石支架體內(nèi)降解的研究

李 蕾，劉小元，張 凱，韓祥禎，周琦琪，何惠宇

頜面部較大骨缺損是目前世界上較為普遍的臨床問題之一，大部分頜面部骨缺損修復(fù)在臨床上仍然需要骨移植或使用骨替代材料[1-2]。支架材料除了具有促進(jìn)成骨能力外，還應(yīng)有一定的降解性能，因此可降解支架是目前骨組織工程的研究熱點(diǎn)。絲素蛋白相關(guān)支架在骨缺損處的降解除了與機(jī)體的免疫有關(guān)外，還與支架所處骨缺損處的骨改建過程密不可分，骨再生過程中骨的形成和吸收保持一定的平衡，這一過程較為復(fù)雜，由多種通路、多種因子參與。巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)有利于破骨細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和擴(kuò)散。骨吸收過程中鈣調(diào)磷酸酶/活化T細(xì)胞核因子(calcineurin/nuclear factor of activated T cells，CN/NFAT)通路也發(fā)揮重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)活化T細(xì)胞核因子1(nuclear factor of activated T cells1, NFATc1)在破骨細(xì)胞形成過程中有一定的調(diào)節(jié)作用[3]。而在骨改建的過程中，除了NFATc1，白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、M-CSF等因子也與破骨細(xì)胞相關(guān)。因此我們將膜片包裹的支架植入動(dòng)物體內(nèi)，觀察支架在體內(nèi)以及其周圍組織的變化，并檢測(cè)與支架降解相關(guān)的因子，觀察兩種不同支架之間降解相關(guān)因子表達(dá)的不同，比較兩種支架的降解性能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

10 kg左右的4～6月齡阿勒泰大尾羊2只、(35.52±1.20)kg的12月齡阿勒泰大尾羊12只，雌雄不限。在新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心(編號(hào)：IACUC20170706-04)圈養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中參照相關(guān)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的條例對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行處置。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

20 nm 羥基磷灰石(南京埃普瑞公司，中國(guó))；碳酸鈉(分析純)、溴化鋰(分析純)、蠶繭、電子天平(Sartorius BSA124S)(新疆醫(yī)科第一附屬醫(yī)院提供)；三維打印成型機(jī)(新疆大學(xué))，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；α-MEM培養(yǎng)液(Hyclone，美國(guó))；速眠新、新速醒、戊巴比妥(天津化學(xué)試劑，中國(guó))；舒泰?50(Virbac S.A，法國(guó))；熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX96，美國(guó))；SF/PVA/n-HA支架、PVA/n-HA支架(新疆大學(xué)、新疆醫(yī)科大學(xué))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 3D打印 SF/PVA/n-HA和PVA/n-HA支架

參照本課題組前期試驗(yàn)方法使用3D打印技術(shù)分別打印絲素蛋白/聚乙烯醇/納米羥基磷灰石(SF/PVA/n-HA)支架與聚乙烯醇/納米羥基磷灰石(PVA/n-HA)支架[4]。

1.3.2 羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片的培養(yǎng) 4～6月齡阿勒泰大尾羊固定四肢后，肌內(nèi)注射舒泰(10 mg/kg)和新速眠(0.1～0.2 mL/kg)麻醉。在髂骨平臺(tái)區(qū)抽取羊骨髓(圖1A)4～5 mL后轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)過濾后加入5～6 mL培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入細(xì)胞瓶培養(yǎng)(圖1B)。待二代細(xì)胞量達(dá)到80%～90%時(shí)將細(xì)胞接種至60 mm2的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。等皿底細(xì)胞量達(dá)到100%后，采用連續(xù)誘導(dǎo)法構(gòu)建骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bore marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)膜片(圖1C)。

A：抽取羊BMSCs；B：羊BMSCs培養(yǎng)；C：羊 BMSCs膜片圖1 羊BMSCs膜片的培養(yǎng)Fig.1 Cultivation of sheep BMSCs patch

1.3.3 支架植入 用膜片分別包裹SF/PVA/n-HA支架和PVA/n-HA支架備用，然后選12月齡阿勒泰大尾羊制備下頜骨缺損模型。分別植入對(duì)應(yīng)支架，實(shí)驗(yàn)組為SF/PVA/n-HA支架復(fù)合細(xì)胞膜片，對(duì)照組為PVA/n-HA支架復(fù)合細(xì)胞膜片，空白組為明膠海綿復(fù)合細(xì)胞膜片(膜片組)。術(shù)前3%戊巴比妥鈉0.005～0.020 mg/kg，靜脈推注麻醉，口內(nèi)外常規(guī)消毒。用牙科慢速手機(jī)制備骨缺損，同時(shí)生理鹽水間斷沖洗降溫。骨缺損大小為20 mm×5 mm×3 mm(圖2)[5-6]。最后植入細(xì)胞膜片包裹的支架，嚴(yán)密縫合。術(shù)后連續(xù)3 d肌內(nèi)注射慶大霉素防止繼發(fā)感染。

A：制備骨缺損；B：植入細(xì)胞膜片復(fù)合SF/PVA/n-HA支架；C：植入細(xì)胞膜片復(fù)合PVA/n-HA支架圖2 下頜骨植入支架Fig.2 Stents implanted in mandible

分別于術(shù)后1、2、3個(gè)月處死相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)羊，取羊下頜骨，在冰上去除下頜骨實(shí)驗(yàn)部位周圍軟組織，最后將處理好的標(biāo)本標(biāo)記清楚后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱冷凍保存。

1.4 支架植入后指標(biāo)檢測(cè)

大體觀察：在處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之前定期觀察羊的進(jìn)食情況，早期創(chuàng)口處縫線是否脫落，支架在植入后是否脫落，創(chuàng)口處及植入部位骨組織愈合情況。

錐形束CT檢測(cè)：取樣本進(jìn)行錐形束CT檢測(cè)，檢測(cè)條件為將保鮮膜包裹的樣本置于掃描臺(tái)上進(jìn)行三維掃描，然后選取頰舌向最寬處進(jìn)行分析。觀測(cè)3D打印組織工程骨在體內(nèi)骨密度變化情況，比較體內(nèi)降解支架回植前后降解情況。

HE染色分析：造模成功后術(shù)后1、2、3個(gè)月每月取對(duì)應(yīng)4只實(shí)驗(yàn)羊處死，分別取邊緣區(qū)、中央?yún)^(qū)的標(biāo)本，先用40 g/L多聚甲醛固定液沖洗，然后將標(biāo)本置于10%甲醛固定液中固定24 h。用15% EDTA脫鈣液脫鈣，待用大頭針能輕松刺進(jìn)骨組織時(shí)說明脫鈣程度達(dá)標(biāo)，然后將標(biāo)本包埋切片，做HE染色。

Trizol法提取羊骨總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總的RNA濃度和純度，若其濃度和純度均達(dá)標(biāo)才能逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA，最后用PCR試劑盒SYBR Green PCR Kit(500)檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)：IL-1、M-CSF、IL-6、NFATc1的表達(dá)量。引物由上海生工公司設(shè)計(jì)，具體引物序列見表1。相同基因重復(fù)測(cè)量3次取平均值。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence for RT-PCR

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察

植入手術(shù)結(jié)束后，所有實(shí)驗(yàn)羊均存活。術(shù)后3 d，實(shí)驗(yàn)羊因切口位于口內(nèi)，進(jìn)食困難，盡量流食喂養(yǎng)，4 d后進(jìn)食恢復(fù)正常，切口愈合良好，口內(nèi)縫線部分脫落。術(shù)后1、2、3個(gè)月分別處死后，取出下頜骨可見支架植入部位肌肉黏膜覆蓋完全，無明顯瘢痕。剝離植入部位表面肌肉以及黏膜后，可見SF/PVA/n-HA支架復(fù)合膜片組植入部位在術(shù)后1～2個(gè)月軟組織逐漸長(zhǎng)入支架，3個(gè)月時(shí)支架已完全被骨膜包裹，肉眼無法分辨，觸摸質(zhì)地較硬。而PVA/n-HA支架復(fù)合膜片組植入部位在術(shù)后1～2個(gè)月軟組織部分長(zhǎng)入，但長(zhǎng)入程度明顯低于SF/PVA/n-HA支架。3個(gè)月時(shí)PVA/n-HA支架植入部位還可看見部分支架，觸摸時(shí)質(zhì)地略軟，可見支架與周圍骨邊界明顯的分界線(圖3)。

2.2 組織學(xué)觀察

術(shù)后1個(gè)月，SF/PVA/n-HA支架復(fù)合膜片組與PVA/n-HA支架復(fù)合細(xì)胞膜片組可見疏松網(wǎng)狀結(jié)締組織包裹支架，散在分布成纖維細(xì)胞及炎癥細(xì)胞，支架材料開始降解，SF/PVA/n-HA支架復(fù)合膜片組支架材料降解更明顯；而膜片組可見大量疏松網(wǎng)狀結(jié)締組織，少量炎癥細(xì)胞，新生血管幾乎沒有。術(shù)后2個(gè)月，支架進(jìn)一步降解，降解支架周圍可見纖維結(jié)締組織包繞，SF/PVA/n-HA支架復(fù)合膜片組及PVA/n-HA支架復(fù)合膜片組均可見炎癥細(xì)胞及纖維結(jié)締組織；膜片組與術(shù)后1個(gè)月相比無明顯變化，可見大量纖維結(jié)締組織，炎癥細(xì)胞少見。術(shù)后3個(gè)月，SF/PVA/n-HA支架復(fù)合膜片組支架材料幾乎完全降解，被新的纖維組織、骨組織取代，也可發(fā)現(xiàn)少許巨噬細(xì)胞，炎癥細(xì)胞較其他兩組最少；PVA/n-HA支架復(fù)合膜片組仍可見支架殘留物，膜片組可見少量新生血管，炎癥細(xì)胞減少(圖4)。

A：SF/PVA/n-HA支架復(fù)合膜片組術(shù)后3個(gè)月局部組織大體觀察；B:PVA/n-HA支架復(fù)合膜片組術(shù)后2個(gè)月局部組織大體觀察；箭頭指示植入支架位置圖3 大體觀察Fig.3 General observation

2.3 降解相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

同一時(shí)間不同材料比較，SF/PVA/n-HA支架復(fù)合膜片組、PVA/n-HA支架復(fù)合膜片組分別與膜片組相比較P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SF/PVA/n-HA支架復(fù)合膜片組與PVA/n-HA支架復(fù)合膜片組相比，IL-1、IL-6、MCS-F、NFATc1四種因子表達(dá)趨勢(shì)相近(圖5)。在術(shù)后1、2個(gè)月，SF/PVA/n-HA支架復(fù)合膜片組四種因子的mRNA表達(dá)量均高于PVA/n-HA支架復(fù)合膜片組；術(shù)后3個(gè)月時(shí)，四種因子mRNA表達(dá)量SF/PVA/n-HA支架復(fù)合膜片組均低于PVA/n-HA支架組(P<0.05)。

黑色箭頭指向剩余支架材料區(qū)，綠色箭頭指向炎癥細(xì)胞區(qū)，藍(lán)色箭頭指向骨陷窩區(qū)域，白色箭頭指向巨噬細(xì)胞圖4 植入不同時(shí)間點(diǎn)HE染色觀察( ×10)Fig.4 Observation of HE staining after implanting at different time( ×10)

3 討 論

骨組織工程中支架結(jié)合細(xì)胞、生長(zhǎng)因子植入骨缺損處，為大面積的骨缺損提供了可行的思路。近幾年人們將研究方向集中在支架的降解性能上，然而支架植入后其降解性能受支架自身的理化性能、植入部位的體內(nèi)環(huán)境等影響較為復(fù)雜，具備降解性又能與體內(nèi)環(huán)境相適應(yīng)的支架是骨組織工程骨的必備條件。因此，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)支架降解率受到廣泛關(guān)注。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以提高材料的生物活性，并為骨形成提供合適的微環(huán)境[7]。支架上種子細(xì)胞密度是提高支架移植治療效果的重要因素之一，而與單細(xì)胞移植相比，移植層狀細(xì)胞膜片(cell sheet)可以促進(jìn)相應(yīng)功能的恢復(fù)和骨組織再生。細(xì)胞膜片技術(shù)(cell sheet technology， CST)也稱細(xì)胞片層技術(shù)，是種子細(xì)胞利用自身的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)形成的數(shù)層致密細(xì)胞聚合體，也是目前骨組織工程的常用方法之一[8]。因此本實(shí)驗(yàn)前期選用4～6月齡阿勒泰大尾羊培養(yǎng)羊BMSC膜片，以確保骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活性。用其包裹支架后再將支架植入12月齡阿勒泰大尾羊下頜骨內(nèi)，12月齡的阿勒泰大尾羊已經(jīng)達(dá)到成年?duì)顟B(tài)，生長(zhǎng)發(fā)育穩(wěn)定，支架植入后骨改建相對(duì)平穩(wěn)。

**：P<0.05圖5 術(shù)后不同時(shí)期各組相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的比較Fig.5 Comparison of the expression of related cytokine in each group during different periods after surgery

絲素蛋白的降解與流變學(xué)和力學(xué)性能有關(guān)[9]。將SF/PVA/n-HA支架植入阿勒泰大尾羊下頜骨后，羊在咀嚼食物時(shí)支架受力，力通過黏膜傳遞到支架，從而加速支架降解；植入部位位于下頜骨內(nèi)，該部位血運(yùn)豐富，有利于支架降解。

支架植入后會(huì)激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，在后續(xù)的止血、組織愈合過程里，固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)相繼發(fā)揮作用[10]。因此，支架材料良好的生物相容性能避免不良的炎癥反應(yīng)，便于支架成功植入。組織學(xué)觀察中，兩種支架均能引起組織異物反應(yīng)，但SF/PVA/n-HA支架植入?yún)^(qū)術(shù)后1、2、3個(gè)月HE染色觀察發(fā)現(xiàn)炎癥逐漸減輕，表明SF/PVA/n-HA支架植入后異物反應(yīng)隨著支架的降解，炎癥反應(yīng)隨之減輕。同時(shí)SF/PVA/n-HA支架周圍新生血管較PVA/n-HA支架多，表明絲素蛋白可促進(jìn)血管形成，這與Zhang等[11]研究相符。支架材料降解時(shí)，細(xì)胞作用不可忽視，巨噬細(xì)胞是其中重要的一員，它的吞噬作用和其釋放的細(xì)胞因子可以加速材料降解的速率[12]。SF/PVA/n-HA支架組織學(xué)觀察中發(fā)現(xiàn)支架降解過程中，有巨噬細(xì)胞的出現(xiàn)，我們可以大膽猜測(cè)巨噬細(xì)胞的出現(xiàn)與SF/PVA/n-HA支架的降解有密不可分的關(guān)系。

不同支架植入體內(nèi)后，機(jī)體的固有免疫系統(tǒng)、適應(yīng)性免疫系統(tǒng)相繼發(fā)揮作用[13-14]。中性粒細(xì)胞在此過程中清除死亡細(xì)胞并且分泌趨化因子招募巨噬細(xì)胞。有研究者發(fā)現(xiàn)絲素在降解過程與巨噬細(xì)胞密切相關(guān)[15]。在此過程中，巨噬細(xì)胞也會(huì)分泌IL-1、IL-6等促炎細(xì)胞因子，招募其他炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞。除此之外，IL-6也可促進(jìn)骨吸收，對(duì)破骨細(xì)胞的形成也有一定的促進(jìn)作用[16]。而巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α和IL-6細(xì)胞因子除了抑制成骨細(xì)胞合成堿性磷酸酶，還能抑制細(xì)胞外骨基質(zhì)的分泌和礦化[17]。因此在此次實(shí)驗(yàn)中，我們選擇IL-1、IL-6這兩種因子作為支架植入之后評(píng)價(jià)支架降解的指標(biāo)。從RT-PCR結(jié)果可以看出，在支架植入術(shù)后1、2、3個(gè)月內(nèi)，SF/PVA/n-HA支架復(fù)合膜片組(有絲素支架組)IL-1、IL-6的相對(duì)表達(dá)量均高于PVA/n-HA支架復(fù)合膜片組(無絲素支架組)(P<0.05)，說明在前兩個(gè)月，有絲素支架在植入后，巨噬細(xì)胞發(fā)揮作用，促進(jìn)支架降解，與此同時(shí)，分泌IL-1、IL-6細(xì)胞因子，因此IL-1、IL-6的相對(duì)表達(dá)量高于無絲素組，在術(shù)后3個(gè)月時(shí)，有絲素支架組支架的降解接近尾聲，巨噬細(xì)胞量減少，IL-1、IL-6相對(duì)表達(dá)量低于無絲素支架組(P<0.05)。而且有研究發(fā)現(xiàn)，在降解過程中產(chǎn)生SF顆粒在先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的影響具有一定的抗腫瘤活性[18]，這可能是3個(gè)月末IL-1和IL-6表達(dá)降低的另一個(gè)可能原因。

骨再生與骨吸收是相互平衡的，支架一方面需要為成骨細(xì)胞的發(fā)育創(chuàng)造最佳條件，另一方面也需要確保破骨細(xì)胞能夠發(fā)揮其主要作用，為骨形成提供相應(yīng)的空間。因此，研究破骨細(xì)胞相關(guān)因子在新型生物材料上的分泌情況和功能具有重要意義。巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞均可產(chǎn)生M-CSF[19-20]。有研究發(fā)現(xiàn)M-CSF是促進(jìn)破骨細(xì)胞進(jìn)一步成熟化的關(guān)鍵因子[21]。NFATc1在骨吸收過程中調(diào)節(jié)與破骨細(xì)胞相關(guān)的基因表達(dá)。破骨細(xì)胞形成早期，RANKL與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞上的RANK結(jié)合，將細(xì)胞內(nèi)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 (tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)招募到RANK的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，從而刺激多種下游信號(hào)通路，包括核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB,NF-κB)、絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和核活化T細(xì)胞因子(NFAT)通路[22]。NFATc1與破骨細(xì)胞的分化增殖密切相關(guān)[23]。在PCR結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)前兩個(gè)月，有絲素支架組其M-CSF、NFATc1的mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于無絲素支架組(P<0.05)，說明有絲素支架組的破骨細(xì)胞活動(dòng)活躍，這與組織學(xué)觀察結(jié)果一致。在術(shù)后3個(gè)月，有絲素支架組M-CSF、NFATc1的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低，且低于無絲素支架組(P<0.05)，說明此時(shí)破骨細(xì)胞活躍度降低，骨吸收減弱，骨改建已經(jīng)趨近尾聲。而無絲素支架組M-CSF、NFATc1的mRNA相對(duì)表達(dá)量高于有絲素組，說明骨吸收在術(shù)后3個(gè)月還在繼續(xù)。

4 結(jié) 論

具有良好的孔隙率和力學(xué)性能的SF/PVA/n-HA支架，植入體內(nèi)后生物相容性好，引起的炎癥反應(yīng)較少，且在體內(nèi)環(huán)境的作用下支架逐漸降解，在支架降解過程中新骨形成。因此SF/PVA/n-HA支架可作為骨組織工程中的一種新型支架材料。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)過程中，支架受到炎癥反應(yīng)和骨改建過程的雙重調(diào)控，發(fā)現(xiàn)SF/PVA/n-HA支架降解過程中M-CSF、IL-6等因子的相對(duì)表達(dá)量發(fā)生了變化。參加免疫反應(yīng)的因子也參加了骨改建過程，這些因子之間的關(guān)系以及它們之間是否相互影響還需進(jìn)一步研究。