冬凌草甲素對乳腺癌MCF-7細胞氟維司群耐藥的逆轉作用及機制

胡高波，邱惠萍，金 湛，姜莉苑，姚水洪

（衢州職業技術學院醫學院，浙江 衢州 324000）

乳腺癌是影響女性身心健康甚至危及生命的最常見惡性腫瘤。據WHO國際癌癥研究機構（IARC）發布的2020年全球最新癌癥負擔數據顯示，2020年全球新發乳腺癌226萬例，首次超過肺癌成為全球第一大癌癥，占新發癌癥病例的11.7%。而中國是乳腺癌大國，2020年新發乳腺癌約42萬例，并導致近12萬人死亡[1]。目前乳腺癌的治療主要有手術、放療、化療和內分泌治療等，其中化療具有縮小病灶，減少切除范圍，縮小手術造成的傷殘，提高乳腺癌患者的存活率等優勢，是乳腺癌全身治療的主要治療手段[2]。但化療藥物產生的不良反應和耐藥性是化療失敗最主要的原因之一，限制了其臨床應用[3]。氟維司群（fulvestrant，Ful）是近年來開發的一種新型抗雌激素受體（estrogen receptor，ER）藥物[4-6]，被美國 FDA批準用來治療抗雌激素治療失敗的絕經后晚期乳腺癌患者，然而乳腺癌細胞對其產生的獲得性耐藥現象仍然是臨床治療的主要障礙[7]。

冬凌草甲素（oridonin，Ori）對腫瘤具有很強的預防和治療作用，能抑制肝癌、卵巢癌及胃癌等多種腫瘤細胞增殖[8-10]，其具體機制可能與阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡、引起DNA損傷等有關[11-14]。有研究表明，Ori還對胃癌細胞耐藥性具有逆轉作用[15-16]，但關于Ori逆轉耐藥的研究還處于起始階段，是否能逆轉乳腺癌Ful耐藥尚未見文獻報道。本研究通過構建MCF-7細胞耐Ful耐藥細胞株MCF-7/Ful，觀察Ori對乳腺癌Ful耐藥性的逆轉作用，探討其可能的作用機制，為進一步研究腫瘤耐藥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物、試劑和主要儀器

人乳腺癌細胞MCF-7（中國科學院上海細胞庫）。Ori（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；Ful（純度≥98%，美國Sigma公司）。噻唑藍（MTT）、EB染色液和吖啶橙染色液（北京索萊寶科技有限公司）；DMEM培養液和胎牛血清（美國Hyclone公司）；AnnexinⅤ/PI細胞凋亡檢測試劑盒和細胞周期試劑盒（美國BD公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天公司）；兔抗人組蛋白γH2AX、Bcl-2、Bax、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶9、周期蛋白D1、細胞分裂周期蛋白2（cell cycle-reated protein 2，cdc2）、磷酸化cdc2（p-cdc2）、微管相關蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）Ⅱ/Ⅰ單抗、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體（二抗）（均為美國Cell Signaling Technology公司）；ECL顯色液（上海西唐生物科技有限公司）。Herocell 180二氧化碳培養箱（上海潤度生物科技有限公司）；3001型全自動酶標儀（美國Thermo公司）；Ti2-U熒光倒置顯微鏡（日本尼康公司）；Powerpac basic電泳儀（美國Bio-Rad公司）；3300 mini化學發光成像系統（中國CLinX公司）；Guava Easycyte流式細胞儀（美國Minipore公司）。

1.2 MCF-7/Ful耐藥細胞株構建和細胞培養

乳腺癌細胞株MCF-7常規培養于含10%胎牛血清、青霉素200 U·mL-1、鏈霉素 200 U·mL-1的DMEM培養液中。于培養液中加Ful，使培養液中 Ful終濃度為 1 μmol·L-1，壓力篩選耐藥細胞12個月，制備耐藥細胞株MCF-7/Ful。12個月后，調整Ful濃度為0.5 μmol·L-1，置37℃、5% CO2培養箱內繼續培養以維持其耐藥性。

1.3 MTT實驗

1.3.1 MCF-7/Ful細胞耐藥指數檢測

取對數生長期MCF-7和MCF-7/Ful細胞以每孔3000細胞的密度接種到96孔板中，細胞貼壁后分別加Ful，最終濃度分別為0（細胞對照組），2，4，8和16 μmol·L-1每個濃度設置4個復孔，同時設空白對照組，置37℃培養箱48 h后，每孔加20 μL ΜTT（5g·L-1）溶液，繼續培養4 h后，每孔加200 μL三聯液，繼續培養過夜，酶標儀570 nm條件下測定吸光度（absorbance，A570nm）值，檢測細胞存活率。細胞存活率（%）=（加藥組A570nm-空白對照組A570nm）（/細胞對照組A570nm-空白對照組A570nm）×100%。采用Graphpad prism 5軟件計算半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50），并計算耐藥指數（resistance index，RI），RI=MCF-7/Ful細胞IC50/MCF-7細胞IC50。

1.3.2 Ori對MCF-7/Ful細胞的逆轉倍數檢測

根據預實驗結果，選取細胞存活抑制率＜5%的最大Ori濃度，即 5 μmol·L-1作為逆轉濃度。對數生長期的MCF-7/Ful細胞，Ori 5 μmol·L-1聯合Ful 0，2，4，8和16 μmol·L-1孵育48 h后進行MTT實驗，計算IC50，根據Ful單獨用藥和與Ori聯合用藥的IC50值計算逆轉倍數。逆轉倍數=Ful單藥組IC50/Ful+Ori組 IC50。

1.4 MCF-7/Ful耐藥細胞分組和藥物處理

對數生長期MCF-7/Ful細胞，隨機分為細胞對照組、Ful 8 μmol·L-1組、Ori 5 μmol·L-1組和 Ful+Ori組。MCF-7/Ful細胞以密度6×105·L-1接種于6 cm培養皿中，培養24 h待細胞貼壁，加相應濃度藥物作用24 h，進行后續實驗。

1.5 彗星實驗檢測MCF-7/Ful細胞拖尾

取1.4分組處理后的細胞，消化，取細胞懸液10 μL，向其中加0.7%低熔點瓊脂糖磷酸緩沖鹽溶液（用PBS配制）70 μL，混勻后迅速滴于37℃預熱的玻片上，隨后進行固化，裂解、避光、解旋、電泳。取出玻片，滴加EB染色液，熒光顯微鏡下觀察拖尾，測量拖尾長度。

1.6 流式細胞術檢測MCF-7/Ful細胞周期

取1.4分組處理后的細胞，用PBS洗2遍，用胰酶消化后，用PBS重懸細胞，洗滌離心后立即加70%冰乙醇，4℃過夜后將細胞懸液在離心機上離心（3000×g，5 min），吸去用于固定的乙醇，再用冷的PBS洗滌細胞2次，除去上清液，加入含有RNase的PI染液，避光室溫染色30 min，流式細胞儀檢測各組細胞的熒光強度，ModFit LT 4.0軟件分析細胞周期分布。

1.7 流式細胞術檢測MCF-7/Ful細胞凋亡率

取1.4分組處理的細胞，PBS洗2遍，胰酶消化后用PBS重懸細胞，離心后加1×結合緩沖液500 μL重懸細胞，分別加10 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI，避光孵育10 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.8 吖啶橙染色定性檢測MCF-7/Ful細胞自噬

取1.4分組處理后的細胞，去除上清液，PBS洗滌2次，用胰酶消化后離心（800×g，5 min）收集細胞，再用PBS洗滌2次后進行染色（吖啶橙染料1 μg·mL-1孵育 15 min，室溫避光）。PBS 再洗2次除去染料。吸取10 μL細胞懸液于載玻片上，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下進行拍照。自噬細胞出現橙紅色點狀體，以橙紅色熒光強度表示自噬程度。

1.9 Western印跡法檢測MCF-7/Ful細胞 γ-H2AX、Bcl-2、Bax、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶9和周期蛋白D1蛋白表達水平及cdc2蛋白磷酸化水平和LC3Ⅱ/Ⅰ比值

取1.4分組處理后的細胞，加入裂解液，冰上裂解30 min后離心（14 000×g）取上清，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，處理蛋白隨后上樣。用SDSPAGE分離總蛋白，隨后用濕轉法轉移至PVDF膜上，一抗4℃過夜（稀釋比為1∶1000），二抗（稀釋比為1∶5000）室溫孵育1 h后顯影，利用Image-Pro Plus 6.0軟件進行積分吸光度（integrated absorbance，IA）值分析，GAPDH作為內參，以目標蛋白與內參的IA比值表示蛋白的相對表達量，p-cdc2與cdc2的比值表示蛋白磷酸化水平，LC3Ⅱ/Ⅰ比值表示細胞自噬水平。

1.10 統計學分析

實驗結果數據以±s表示，用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，采用單因素方差分析；組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MCF-7/Ful細胞耐藥指數和Ori對MCF-7/Ful細胞的逆轉倍數

MTT結果如圖1所示，Ful濃度≥8 μmol·L-1時，MCF-7/Ful細胞存活率顯著大于MCF-7細胞（P＜0.05）。通過計算得到Ful對MCF-7細胞的IC50為（6.0±1.0）μmol·L-1，對 MCF-7/Ful細胞的 IC50為（52.3±5）μmol·L-1，差異具有統計學意義（P＜0.01），MCF-7/Ful細胞對Ful的RI為8.7。

Fig.1 Effect of fulvestrant（Ful）on the proliferation of MCF-7 and MCF-7/Ful cells.MCF-7 and Ful-resistant MCF-7（MCF-7/Ful）cells were added with Ful 0，2，4，8 and 16 μmol·L-1，respectively，and incubated for 48 h.±s，n=4.＊P＜0.05，compared with corresponding MCF-7 cell group.

如圖 2結果所示，Ful濃度≥4 μmol·L-1時，Ful+Ori對MCF-7/Ful細胞存活抑制率顯著高于Ful單用組（P＜0.05），Ful+Ori的IC50為（12.4±1.6）μmol·L-1，Ful單用為（52±8）μmol·L-1，Ori對MCF-7/Ful細胞耐藥逆轉倍數為4.2。

Fig.2 Effect of Ful alone and Ful+oridonin（Ori）on the proliferation of MCF-7/Ful cells.MCF-7/Ful cells were incubated with Ori 5 μmol·L-1+Ful 0，2，4，8 and 16 μmol·L-1for 48 h.±s，n=4.＊P＜0.05，compared with Ful group.

2.2 Ori對MCF-7/Ful細胞損傷的影響

彗星實驗結果如圖3所示，細胞對照組形態清晰圓潤，無明顯拖尾現象，尾長為（4.4±0.8）μm，Ful組拖尾長度為（11.2±2.5）μm，Ori組為（16.5±3.7）μm，Ori+Ful組為（34.6±5.9）μm，拖尾現象更加明顯（P＜0.01）。

Fig.3 Effect of Ori on MCF-7/Ful cell damage by comet assay.MCF-7/Ful cells were divided into cell control group，Ful 8 μmol·L-1group，Ori 5 μmol·L-1group and Ful+Ori group，and treated for 24 h.

2.3 Ori對MCF-7/Ful細胞周期的影響

流式結果（圖4）顯示，細胞對照組G0/G1期細胞百分比為（55.6±2.0）%，Ful組、Ori組和Ful+Ori組細胞的G0/G1期細胞百分比分別為（57.1±1.4）%，（63.5±2.6）%和（76.5±3.4）%。與細胞對照組和Ful組相比，Ful+Ori組G0/G1期細胞百分比顯著升高（P＜0.05）。

Fig.4 Typical flow cytometry of Ori on the cell cycle of MCF-7/Ful.See Fig.3 for the cell treatment.

2.4 Ori對MCF-7/Ful細胞總凋亡率的影響

各組細胞凋亡情況如圖5所示，與細胞對照組相比，Ful組、Ori組和Ful+Ori組細胞總凋亡率均顯著增加（P＜0.05）。與Ful組相比，Ful+Ori組總凋亡率顯著增加（P＜0.05）。

Fig.5 Effect of Ori on apoptosis of MCF-7/Ful cells by flow cytermetry.See Fig.3 for the cell treatment.B was the semiquantitive result of A.±s，n=4.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with Ful group.

2.5 Ori對MCF-7/Ful細胞自噬的影響

如圖6所示，正常對照組細胞可觀察到大面積綠色熒光，而在Ful組、Ori組以及Ful+Ori組中綠色熒光逐漸轉變成橙紅色熒光，其中Ful+Ori組橙紅色光最顯著。與細胞對照組相比，Ful組、Ori組以及Ful+Ori組細胞自噬程度顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。與Ful組相比，Ful+Ori組細胞自噬程度顯著增加（P＜0.05）。

Fig.6 Effect of Ori on autophagy in MCF-7/Ful cells by acridine orange staining.See Fig.3 for the cell treatment.B was the semi-quantitive result of A.±s，n=4.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with Ful group.

2.6 Ori對 MCF-7/Ful細胞 γ-H2AX、Bcl-2、Bax、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶9、周期蛋白D1蛋白表達水平，cdc2磷酸化水平和LC3Ⅱ/Ⅰ比值的影響

DNA損傷標志性蛋白γ-H2AX表達如圖7（A1和A2）顯示，與細胞對照組相比，Ori組和Ful+Ori組細胞中γ-H2AX蛋白表達顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），與Ful組相比，Ful+Ori組γ-H2AX蛋白表達顯著升高（P＜0.01）。細胞凋亡相關蛋白表達如圖7（B1和B2）所示，與細胞對照組相比，Ful組細胞Bcl-2表達顯著降低（P＜0.05），Bax表達顯著升高（P＜0.05），Ori組細胞Bax、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶9表達顯著升高（P＜0.05）。Ful+Ori組細胞較細胞對照組和Ful組中Bcl-2表達均顯著降低，Bax、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶9表達均顯著升高（P＜0.01）。細胞周期相關蛋白表達如圖7（C1和C2）所示，與細胞對照組相比，Ful+Ori組細胞中周期蛋白D1表達顯著降低（P＜0.05），Ful組、Ori組以及Ful+Ori組p-cdc2/cdc2比值顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。與Ful組相比，Ful+Ori組細胞周期蛋白D1表達顯著降低（P＜0.05），p-cdc2/cdc2比值顯著升高（P＜0.01）。Ful+Ori組細胞較細胞對照組和Ful組細胞LC3-Ⅱ/Ⅰ比值顯著增加（P＜0.05）（圖7D1和D2）。

Fig.7 Effect of Ori on protein expressions of γ-H2AX，apoptotic-related proteins，cyclin D1，phosphorylation level of cell cycle-related protein 2(cdc2)and ratio of microtubule-associated protein light chain 3（LC3）Ⅱ/Ⅰof MCF-7/Ful cells detected by Western blotting.See Fig.3 for the cell treatment.A2，B2，C2 and D2 were the semi-quantitative result of A1，B1，C1 and D1，respectively.±s，n=4.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with Ful group.

3 討論

本研究發現，Ori可能通過誘導乳腺癌MCF-7/Ful細胞產生DNA損傷達到逆轉MCF-7/Ful耐藥性的效果，其耐藥逆轉倍數為4.2。Ori組和Ful+Ori組細胞中γ-H2AX蛋白表達顯著升高，也驗證了這一結果，γ-H2AX被視為DNA損傷的標志物，其表達量高低與DNA損傷的程度呈正相關，DNA損傷是許多藥物發揮抗腫瘤作用的重要機制[17-18]。

抗癌藥物可誘導癌細胞DNA雙鏈斷裂，促進細胞凋亡[19]，或通過誘導DNA的異常嵌入和損傷，催化下游底物包括細胞周期相關因子等進一步磷酸化[20]，從而逆轉腫瘤耐藥性。細胞G0/G1期是DNA物質準備階段，受到多種調控蛋白調節，周期蛋白D1作為調節因子之一，可促進細胞由G0/G1期向S期轉變[21]，cdc2磷酸化可促使細胞阻滯于G0/G1期。本研究表明，Ful聯合Ori能顯著上調凋亡相關蛋白Bax、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶9的表達和cdc2磷酸化水平，下調Bcl-2和周期蛋白D1蛋白水平，表明Ful聯合Ori能發揮阻滯MCF-7/Ful細胞的周期和誘導細胞凋亡的作用。

促進腫瘤自噬水平是癌癥治療潛在途徑[22]，LC3Ⅱ是公認的自噬標志蛋白，LC3的出現以及向LC3Ⅱ的轉化合成增多代表著自噬的增強。Ful聯合Ori，能使MCF-7/Ful細胞中LC3Ⅱ表達顯著上調，促進自噬水平的增強。

綜上所述，本研究表明，Ori能逆轉乳腺癌MCF-7/Ful細胞獲得性耐藥，其機制可能是通過誘導MCF-7/Ful細胞產生DNA損傷，進而引起細胞凋亡、細胞周期阻滯以及細胞自噬。