保健用品眼貼制劑霉菌和酵母菌總數定性檢測方法建立

李翠，李林樾，馬鵬飛，楊曉莉

陜西省食品藥品監督檢驗研究院，國家藥品監督管理局藥品微生物檢測技術重點實驗室，陜西 西安 710065

隨著科技的進步，人們眼睛接觸電子屏幕的時間大大增加，致使人們眼部肌肉疲勞，視力下降、眼干、眼澀等癥狀層疊而出，眼部保健用品就應運而生［1］，眼部保健眼貼類產品作為常用的保健用品，因其含有豐富的中藥和營養成分，再加上其存放和生產過程中無法達到無菌條件，所以極易滋生微生物。霉菌和酵母菌很容易感染藥物和食品的致病菌，對動物和人類的健康都會造成嚴重威脅［2-3］，而眼部保健用品因其特殊的使用部位，一旦污染霉菌或酵母菌，將嚴重危害使用者的身體健康。所以，規范此類產品的霉菌和酵母菌的檢測方法，保證其產品的微生物質量可控，勢在必行［4-11］。

目前，保健用品執行的是地方標準，但在《DB61陜西省地方標準 保健用品微生物限度檢查》中并沒有對保健用品眼貼制劑微生物限度檢查的霉菌和酵母菌定性檢驗方法進行規定。國內其他省份的地方標準也無單獨針對保健用品眼貼制劑的霉菌和酵母菌數的定性檢驗方法，急需摸索建立一種準確有效、適合此類產品的霉菌和酵母菌數定性檢測方法。本文選擇兩個不同品牌4 類保健用品眼貼類產品進行試驗，建立了保健用品眼貼類制劑的霉菌和酵母菌數定性檢查方法［12-14］。

1 實驗儀器與材料

1.1 實驗儀器

SWW.105 臥式矩形壓力蒸汽滅菌器，上海華成醫用核子儀器公司；BS2202S 型電子天平，德國賽多利斯公司；HFsafe-1200LC 型生物安全柜，上海力申科學儀器有限公司；SHA-C 型水浴恒溫振蕩器，天津鑫博得有限公司；LRH-250 生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；MJ-250-11 霉菌培養箱，上海齊欣科學儀器有限公司；VITEK2 全自動微生物鑒定系統，法國梅里埃有限公司；OLYMPUS.CH 型三目顯微鏡，日本奧林巴斯公司；渦旋混合器，德國IKA 公司。

1.2 樣品信息及編號

A 牌中老年眼貼。規格：6 g/貼；實驗編號及批號（T1：20180911，T2：20180918，T3：20181014，T4：20181117，T5：20181202）。

A 牌舒緩護眼貼。規格：6 g/貼；實驗編號及批號（T6：20180526，T7：20180610，T8：20180622，T9：20180623，T10：20180703）。

A 牌明目貼。規格：2 g/貼；實驗編號及批號（T11：20180820，T12：20180908，T13：20180915，T14：20181015，T15：20181115）。

B 牌護視明目罩。規格：3.5 g/貼；實驗編號及批號（T16：20180701，T17：20180801，T18：20180901，T19：20180701，T20：20180801）。

1.3 培養基及試劑

霉菌液體培養基（青島高科技工業園海博生物技術有限公司，批號20180730）；0.9%無菌氯化鈉溶液（國藥集團，批號20180926）；胰酪大豆胨液體培養基（TSB，北京陸橋生物技術有限責任公司，批號180527）；沙氏葡萄糖液體培養基（SDB，北京陸橋生物技術有限責任公司，批號180801）；孟加拉紅培養基（北京陸橋生物技術有限責任公司，批號180628）；沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA，北京陸橋生物技術有限責任公司，批號180612）；玉米粉培養基（北京陸橋生物技術有限責任公司，批號181207）；高鹽察氏培養基（北京陸橋生物技術有限責任公司，批號20180923）；氯化三苯四氮唑-沙保羅培養基（北京陸橋生物技術有限責任公司，批號181009）。配制好的培養基適用性檢查符合《中國藥典》2020 年版非無菌產品微生物限度檢查：計數檢查法（通則1105）要求。

1.4 菌種及菌液制備

1.4.1 菌種金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus〔CMCC(B) 26 003〕、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa〔CMCC(B) 10 104〕、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis〔CMCC(B) 63 501〕、白色念珠菌Candida albicans〔CMCC(F) 98 001〕、黑曲霉Aspergillus niger〔CMCC(F) 98 003〕，上述標準菌株均來自中國醫學細菌保藏管理中心，工作用菌株為第3 代。

1.4.2 菌液制備參照《中國藥典》2020 版進行菌液制備：將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌分別接種于胰酪大豆胨液體培養基中，35 ℃培養24 h；將白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖液體培養基中，25 ℃培養3 d。上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；將黑曲霉接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基上，25 ℃培養7 d，加入5 mL 含0.05%聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液，洗脫孢子，收集孢子懸液，用含0.05%聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。

2 實驗方法

全過程進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應無菌生長。

2.1 供試液制備

取樣品10 g，加0.9%氯化鈉溶液至100 mL，45 ℃恒溫水浴振蕩10 min 使其分散均勻，制成1∶10供試液。

2.2 試驗過程

2.2.1 分離平板篩選（1）接種與增菌培養。取制備好的1∶10 供試液，接入含菌量不大于100 cfu 的白色念珠菌菌液和黑曲霉試驗菌液混勻。分別取上述勻液10 mL 接種至胰酪大豆胨液體培養基（TSB）增菌肉湯、沙氏葡萄糖液體培養基（SDB）增菌肉湯和霉菌液體培養基中培養。（2）選擇和分離培養。取上述培養物劃線分離于孟加拉紅瓊脂平板上、氯化三苯四氮唑-沙保羅瓊脂平板、沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）平板、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）平板、察氏瓊脂平板、高鹽察氏培養基、玉米瓊脂平板上，25 ℃培養3 d，結果見表1。

表1 霉菌和酵母菌在不同分離平板上的分離結果

取增菌液分離于上述7 種分離平板，結果在孟加拉紅瓊脂平板、SDA 瓊脂平板和PDA 瓊脂平板上菌落大、形態典型，便于觀察，反之在高鹽察氏瓊脂平板、察氏瓊脂平板、玉米瓊脂平板、氯化三苯四氮唑-沙保羅瓊脂平板上生長的菌落形態小，不易觀察。因此，初步選定分離平板為孟加拉紅瓊脂平板、SDA 瓊脂平板和PDA 瓊脂平板。

2.2.2 增菌培養液的篩選（1）接種與增菌培養。取制備好的1∶10 供試液，接入含菌量不大于100 cfu的白色念珠菌菌液和黑曲霉試驗菌液，同時接入含菌量大于100 cfu 的革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）、革蘭氏陰性菌（大腸埃希菌）、芽孢桿菌（枯草芽孢桿菌）混勻。分別取上述勻液10 mL 接種至90 mL TSB 增菌肉湯、SDB 增菌肉湯、霉菌液體培養基中，培養。（2）選擇和分離培養。取上述培養物劃線分離于孟加拉紅瓊脂平板上、SDA 平板、PDA 平板上，25 ℃培養72 h。結果見表2。（3）結果。取供試液接種至上述3 種增菌培養基進行增菌培養，培養24 h 內在霉菌液體培養基中就可見明顯的霉菌菌絲生長，隨著培養時間延長72 h 增菌液混濁且菌絲越來越豐富，而在TSB 增菌液和SDB增菌液中，需要培養48 h 才出現混濁及可見霉菌菌絲生長，表明霉菌液體培養基的靈敏性要優于其他兩種增菌培養基。將上述三種增菌液分別分離于初選的孟加拉紅瓊脂平板、SDA 平板和PDA 平板，霉菌和酵母菌均生長良好，但在SDA 平板上也可見細菌生長，而因孟加拉紅瓊脂和PDA 瓊脂的配方中添加了一定量的抗生素，不僅對霉菌和酵母菌有較好的促生長能力，且抑制了細菌的生長。

表2 霉菌和酵母菌在不同增菌液培養的試驗結果

2.2.3 培養溫度、時間的考察溫度對霉菌的繁殖及產毒均有重要的影響［15］，不同種類的霉菌最適溫度是不一樣的［16］，大多數霉菌繁殖最適宜的溫度為25 ℃～30 ℃。將不大于100 cfu 的白色念珠菌菌液和黑曲霉試驗菌液接種至霉菌液體培養基中，分別于25 ℃和28 ℃培養，結果見表3。

表3 兩種培養溫度下培養結果

將增菌培養液置25 ℃和28 ℃兩種溫度的培養條件下培養，在28 ℃培養24 h 就可見絮狀菌絲生長，28 ℃培養48 h，增菌液出現明顯的混濁，菌絲豐富，而在25 ℃需要培養至48 h 才出現混濁，可見菌絲生長。試驗菌在28 ℃培養48 h 的培養條件下表現出了良好的促生長能力，滿足了在最短時間內提高檢出率的要求，培養效果優于25 ℃培養48 h，所以選擇28 ℃作為增菌培養溫度。

2.2.4 分離方式、分離平板數目及分離培養時間考察采用劃線和涂布分離的方法對樣品進行分離培養，比較兩種分離方式的回收率。（考慮樣品的檢出率，劃線分離用10 μL 的接種環分別取增菌液一環劃線于3 塊同種分離平板；涂布法采用取增菌液1 mL 分別以0.3 mL/皿、0.3 mL/皿、0.4 mL/皿，涂布于3 塊同種分離平板）。（1）接種與增菌培養。取制備好的1∶10 供試液，接入含菌量不大于100 cfu的白色念珠菌菌液和黑曲霉試驗菌液，混勻，取上述勻液10 mL 接種至霉菌液體培養基中，培養，作為試驗組；接入含菌量不大于100 cfu 的白色念珠菌菌液和黑曲霉試驗菌液至霉菌液體培養基中，作為菌液對照組；取制備好的1∶10 供試液10 mL，接種至霉菌液體培養基中，作為樣品組。（2）選擇和分離培養。取上述培養物分別采用劃線和涂布的方式分離于孟加拉紅瓊脂平板和PDA 瓊脂平板上，28 ℃培養7 d，逐天觀察。結果：取增菌液選擇涂布分離或是劃線分離到一塊選擇性平板上，檢出率均較低，易造成漏檢。采用涂布的方法接種在三塊孟加拉紅瓊脂平板和PDA 瓊脂平板上進行霉菌和酵母菌的分離，檢出率明顯優于劃線的分離方式。分離培養24 h～7 d 時，觀察到目標菌落生長區別不明顯，所以實際操作過程中可結合實際需求，建議分離培養時間控制在72 h～5 d。

3 結果

首先通過不同培養基對目標菌群的增菌試驗發現霉菌液體培養基的增菌效果較好，接著通過分離培養基的篩選試驗，發現在孟加拉紅瓊脂培養基和PDA 培養基的分離平板上的菌落大、形態典型，選擇性較好，進一步進行了分離方式以及分離平板數目的考察，確立選擇采用涂布分離的方式，分別取1 mL 接種于兩種培養基，每種培養基分離于三塊平板，最終建立了保健用品眼貼制劑霉菌和酵母菌定性檢查的方法。此方法通過反復試驗，操作簡便、靈敏度高、結果可靠，可滿足生產企業對產品的質量控制，且可達到DB61 陜西省地方標準保健用品微生物限度檢查中對于眼貼類產品霉菌和酵母菌數結果不得檢出的標準要求。

4 討論

眼貼作為眼部保健類產品，現已被廣泛應用于中老年以及青少年的眼部保健［17］，市面上也出現了讓人眼花繚亂的眼部保健產品［18］，陜西作為保健用品的生產大省，其保健用品的生產檢驗也受到了各生產單位及監管檢驗部門的重視。生產單位在按照地方標準進行保健用品眼貼類產品的檢驗時發現［19-20］，在現有的生產環境下無法滿足地方標準對該制劑的標準要求［21］，而地方標準在該類制劑霉菌和酵母菌的檢測方法項下也未明確給出具體的檢測方法，國家也未有相關的標準出臺，企業產品的生產、檢驗、流通受到了極大的限制。

本研究通過對增菌培養液的篩選、分離培養基的篩選、培養條件的篩選、分離方式以及分離平板數目的考察一系列試驗，初步建立了保健用品眼貼制劑的霉菌和酵母菌數定性檢測方法，現已廣泛應用于陜西的保健用品生產單位。該方法的建立解決了生產企業有標準無方法，無法檢驗的困擾，完善了陜西地方標準保健用品眼貼類制劑的霉菌和酵母菌數檢查方法，也為今后陜西地方標準《保健用品微生物限度檢查》的標準更新提供參考，為保健用品國家標準的建立提供參考。

隨著保健用品消費群體的增多，保健用品檢驗標準的規范也受到大家的重視，而國家尚無統一的保健用品檢驗標準，建議盡快出臺統一的保健用品國家標準，規范市場，保證人民用藥安全，保證消費者的用藥權益。