胃癌患者組織中FOXK1、SPON2表達(dá)的臨床意義及對預(yù)后的影響

許震 左云 張永芹 倪晨

作為目前治療胃癌較為常用的手段，根治性切除術(shù)可切除胃癌病灶組織，阻止疾病進(jìn)展，但由于胃癌早期癥狀并不顯著，發(fā)展至晚期，手術(shù)效果并不理想，術(shù)后極易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，病死率較高[1,2]。因此，尋找與胃癌患者經(jīng)根治性切除術(shù)治療后預(yù)后不良的相關(guān)指標(biāo)對改善患者預(yù)后，降低病死率至關(guān)重要。作為叉頭框家族中重要的蛋白轉(zhuǎn)錄因子，叉頭框轉(zhuǎn)錄因子1(forkhead box k1，F(xiàn)OXK1)與器官發(fā)育、免疫代謝調(diào)節(jié)密切相關(guān)，已被研究證實在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展中占據(jù)重要地位[3]。作為分泌型細(xì)胞外基質(zhì)蛋白家族一員，脊椎蛋白2(spondin 2，SPON2)具有募集炎性細(xì)胞、觸發(fā)先天免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)功能，文獻(xiàn)指出，脊椎蛋白2(spondin 2，SPON2)能夠參與結(jié)直腸癌的發(fā)生及發(fā)展，且是結(jié)直腸癌的治療靶點[4]。結(jié)合FOXK1、SPON2與腫瘤的關(guān)系，推測二者可能與胃癌患者預(yù)后有關(guān)。鑒于此，本研究將重點分析胃癌患者組織中FOXK1、SPON2表達(dá)的臨床意義及對預(yù)后的影響。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究經(jīng)張家港市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，前瞻性選取醫(yī)院2017年1月至2019年12月收治的98例胃癌患者作為研究對象。其中男68例，女30例；年齡54～72歲，平均年齡(62.45±1.98)歲；TNM分期[5]：Ⅰ期21例，Ⅱ期33例，Ⅲ期44例。全部患者及家屬均知情本項研究，并自愿簽署知情同意書。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①胃癌符合《臨床腫瘤學(xué)》[6]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)病理檢查確診；②TNM分期<Ⅳ期；③行腹腔鏡胃癌根治性切除術(shù)治療，且術(shù)后均行化療治療；④胃癌組織標(biāo)本完好。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤疾病，如肝癌、肺癌等；②重要器官功能障礙，如心、肝、腎等；③存在廣泛性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；④其他部位出現(xiàn)癌轉(zhuǎn)移灶，如肺部、肝部等；⑤合并精神性疾病；⑥術(shù)前進(jìn)行放化療治療。

1.3 方法

1.3.1 治療方法:患者取平臥位，行全身麻醉，建立氣腹，將腹腔鏡置入，探查腹腔情況，明確病變部位與周圍組織關(guān)系，采用超聲刀對胃周血管進(jìn)行處理，清掃淋巴結(jié)，完整切除腫瘤及遠(yuǎn)端胃組織后，充分游離賁門、食管，在賁門上方約2 cm處橫向切開食管前壁，置入反穿刺器，采用直線切割器將食管殘端、十二指腸殘端閉死，離斷空腸，吻合食管與遠(yuǎn)端空腸端側(cè)，距吻合口約5 cm處吻合遠(yuǎn)端、近端空腸的斷端；于距臍周約5 cm 處作切口，將切除的腫瘤組織取出，采用蒸餾水沖洗腹腔，于吻合口后方放置引流管，關(guān)閉腹腔，縫合創(chuàng)口，手術(shù)結(jié)束。術(shù)后采用SOX方案化療：注射用奧沙利鉑(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格：50 mg/瓶)，130 mg/m2，靜脈滴注，第1天；替吉奧片(齊魯制藥有限公司，規(guī)格：替加氟20 mg；吉美嘧啶5.8 mg；奧替拉西鉀19.6 mg/片)，40 mg/m2，口服，第1～14天。21 d為1周期，Ⅱ～Ⅲ期患者持續(xù)治療6周期。

1.3.2 基線資料收集方法:設(shè)計臨床資料調(diào)查問卷，收集全部患者基線資料，包括年齡、性別(男、女)、腫瘤最大直徑、TNM分期(Ⅰ～Ⅲ期)、術(shù)后化療(是、否)。

1.3.3 實驗室指標(biāo)檢測方法:術(shù)中獲取患者胃癌組織，進(jìn)行免疫組化學(xué)染色檢測：經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋制成標(biāo)本，連續(xù)切片(厚度為4 μm)后脫蠟、水化。加入3%過氧化氫-甲醇，孵育10 min，消除其中內(nèi)源性過氧化物酶活性，加入0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液，在高溫高壓環(huán)境中修復(fù)抗原，并在10%正常羊血清中孵育30 min。滴加一抗(FOXK1、SPON2兔抗多克隆抗體)在4℃環(huán)境下孵育過夜。待切片恢復(fù)至室溫，采用非生物素辣根過氧化物酶檢測系統(tǒng)進(jìn)行處理。二氨基聯(lián)苯胺(diamino benzidine，DAB)顯色，在光學(xué)鏡下對顯色程度進(jìn)行控制，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。由2名資深病理科醫(yī)師采用雙盲法對染色進(jìn)行評分，若結(jié)果不一，則重新審查病例達(dá)成一致性意見。在顯微鏡下選取不同的5個視野，每個視野細(xì)胞需≥100個，采用雙半定量評分法[7]對免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行評估，其中免疫染色程度：無染色0分，淡黃色1分，黃色至棕黃色2分，棕褐色至褐色3分；免疫染色強度：陽性細(xì)胞百分比<5%為0分，5%≤陽性細(xì)胞百分比≤25%1分；25%<陽性細(xì)胞百分比≤75% 2分，75%<陽性細(xì)胞百分比3分。FOXK1、SPON2免疫染色程度和強度計分乘積>1為陽性。

1.4 預(yù)后評估及分組情況 患者術(shù)后均進(jìn)行為期12個月的隨訪，于術(shù)后1、3、6、9、12個月到院復(fù)查，觀察并記錄2組患者隨訪期間病死、復(fù)發(fā)情況，包括局部復(fù)發(fā)、局部復(fù)發(fā)并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，先經(jīng)CT、腫瘤標(biāo)志物檢測，對可以患者進(jìn)行穿刺活檢確認(rèn)復(fù)發(fā)情況，以復(fù)發(fā)、病死為終點事件。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)后情況 全部98例胃癌患者，術(shù)后經(jīng)為期12個月的隨訪，隨訪時間1～12個月，平均(6.63±0.89)個月；術(shù)后預(yù)后不良17例，占17.35%(17/98)。

2.2 2組基線資料、實驗室指標(biāo)比較 預(yù)后不良組FOXK1、SPON2陽性表達(dá)率高于預(yù)后良好組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；組間其他資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組基線資料、實驗室指標(biāo)比較

2.3 胃癌患者組織中FOXK1、SPON2表達(dá)對預(yù)后影響的Logistic回歸分析 將FOXK1表達(dá)、SPON2表達(dá)納入自變量，對自變量進(jìn)行賦值，將胃癌患者預(yù)后情況作為因變量(1=預(yù)后不良，0=預(yù)后良好)，經(jīng)Logistic回歸分析檢驗，結(jié)果顯示，F(xiàn)OXK1、SPON2表達(dá)陽性可能是胃癌患者預(yù)后不良的影響因素(OR>1，P<0.05)。見表2、3。

表2 自變量說明

表3 胃癌患者組織中FOXK1、SPON2表達(dá)對預(yù)后影響的Logistic回歸分析

2.4 胃癌組織中FOXK1、SPON2表達(dá)預(yù)測胃癌患者預(yù)后不良風(fēng)險價值分析 將胃癌患者預(yù)后情況作為狀態(tài)變量(1=預(yù)后不良，0=預(yù)后良好)，將FOXK1、SPON2表達(dá)作為檢驗變量(FOXK1：1=陽性，0=陰性；SPON2：1=陽性，0=陰性)。繪制ROC曲線圖，結(jié)果顯示，F(xiàn)OXK1陽性、SPON2陽性預(yù)測胃癌患者預(yù)后不良的AUC分別為0.805(AUC的95%CI：0.698～0.913，P<0.001，靈敏度=0.811，特異度=0.800)、0.803(AUC的95%CI：0.680～0.925，P<0.001，靈敏度=0.905，特異度=0.700)，AUC均>0.80，有一定預(yù)測價值。見圖1。

圖1 胃癌組織中FOXK1、SPON2表達(dá)預(yù)測胃癌患者預(yù)后不良風(fēng)險價值的ROC曲線圖

3 討論

胃癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移、侵襲不僅是導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后差的主要原因，也是導(dǎo)致患者病死的根本原因[8]。周穎等[9]研究中指出，胃癌患者預(yù)后不良率為38.00%，本研究中，全部98例胃癌患者，術(shù)后預(yù)后不良17例，占17.35%，低于上述研究，可能與隨訪時間短有關(guān)，仍提示胃癌預(yù)后不良發(fā)生率較高。因此，尋找一種與胃癌術(shù)后預(yù)后不良有關(guān)的指標(biāo)，并采取針對性措施干預(yù)對改善胃癌患者預(yù)后尤為重要。

研究指出，腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展涉及多方面因素；其中胃癌發(fā)生、進(jìn)展的分子機制涉及多種癌基因與抑癌基因的參與及表達(dá)[10,11]。FOXK1是叉頭框(forkhead box，F(xiàn)OX)轉(zhuǎn)錄因子家族編碼的蛋白質(zhì)之一，能夠參與機體細(xì)胞發(fā)育及多種病理過程的調(diào)控作用[12]。SPON2是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，不僅是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，還是腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境相互作用的重要分子基礎(chǔ)[13]。

本研究結(jié)果顯示，預(yù)后不良組FOXK1、SPON2陽性表達(dá)率高于預(yù)后良好組，推測FOXK1、SPON2陽性表達(dá)可能與胃癌患者預(yù)后不良有關(guān)。且該推測經(jīng)進(jìn)一步Logistic回歸分析證實。分析原因在于，F(xiàn)OXK1具有翼螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在胚胎、器官等多種細(xì)胞發(fā)育過程中占據(jù)重要地位，研究指出，抑制FOXK1表達(dá)可有效抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[14,15]。此外，鄧素華[16]研究中指出，F(xiàn)OXK1蛋白可促進(jìn)乳腺癌的惡性發(fā)展，且其表達(dá)越高，患者預(yù)后越差。SPON2可以分泌的形式結(jié)合到細(xì)胞外基質(zhì)上，介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞間的相互作用，其可促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲，在腫瘤及其微環(huán)境的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[17,18]。研究指出，SPON2在多種腫瘤中表達(dá)異常，其過表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，增強腫瘤細(xì)胞的浸潤能力，促進(jìn)腫瘤組織轉(zhuǎn)移，影響預(yù)后[19]。同時，熊晶等[20]研究指出，SPON2與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1過表達(dá)是乳腺癌患者預(yù)后的獨立影響因素。

最后本研究對FOXK1、SPON2表達(dá)預(yù)測胃癌患者預(yù)后不良風(fēng)險繪制了ROC曲線，結(jié)果顯示，F(xiàn)OXK1陽性、SPON2陽性預(yù)測胃癌患者預(yù)后的AUC分別為0.805、0.803，均>0.80，說明FOXK1、SPON2對胃癌有一定的預(yù)測價值。上述結(jié)論證實FOXK1陽性、SPON2陽性是胃癌患者預(yù)后不良的風(fēng)險因子，也可用于預(yù)測胃癌患者預(yù)后不良風(fēng)險程度。這也提示臨床需重點監(jiān)測組織中FOXK1、SPON2蛋白表達(dá)，針對FOXK1、SPON2表達(dá)異常者，建議指導(dǎo)增加患者復(fù)查頻率，叮囑患者適當(dāng)鍛煉，養(yǎng)成良好的生活、飲食習(xí)慣，禁煙酒，少食多餐，以富含維生素、高蛋白食物為主，以降低患者術(shù)后預(yù)后不良風(fēng)險。

本研究雖證實胃癌患者組織中FOXK1、SPON2表達(dá)可影響患者預(yù)后，但曹莉旻等[21]研究中指出，肺癌組織FOXK1、SPON2蛋白陽性表達(dá)的患者預(yù)后差，二者可能發(fā)揮協(xié)同作用，參與肺癌的發(fā)展，進(jìn)而影響患者預(yù)后，而本文并未對胃癌組織中FOXK1、SPON2表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行分析，二者是否協(xié)同導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后不良情況發(fā)生仍不得知，且本研究中隨訪時間尚短，胃癌組織中FOXK1、SPON2表達(dá)對患者遠(yuǎn)期預(yù)后的影響尚不可知，未來仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，胃癌患者預(yù)后不良可能與胃癌組織中FOXK1、SPON2陽性表達(dá)有關(guān)，臨床可指導(dǎo)病理組織中FOXK1、SPON2陽性表達(dá)患者縮短其復(fù)診時間，并密切關(guān)注患者術(shù)后恢復(fù)情況，針對性實施相關(guān)干預(yù)措施，以降低術(shù)后預(yù)后不良風(fēng)險。