金槍魚加工副產物的生物轉化工藝研究

關平彥，夏 磊，楊凌杰，聞正順,，蔡祥敏

(1.浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江舟山 316022；2.舟山市農產品質量安全管理中心，浙江舟山 316021；3.寧波誠元海洋生物科技有限公司，浙江象山 315700)

以海產品的下腳料為原料生產的發酵食品主要有各種海鮮調味料和飼料[1]。低值魚富含蛋白、氨基酸、小分子肽等多種活性礦物質，蛋白含量平均為16%，是制造海鮮調味品的最好原料，目前我國低值魚的出肉率只有35%左右，而廢棄物卻高達65%左右[2]，由于人們對海產品的需求量增大，大量的海產品下腳料被拋棄或低值處理，造成了蛋白質及具備相關活性氨基酸的浪費，也造成了污染問題。我國海產品的下腳料為原料，主要生產海鮮汁，海鮮調味品。

海洋功能性食品是以海洋生物為資源而開發的食品，在優化食品風味的同時提高了食品中氨基酸，蛋白質，不飽和脂肪酸，多糖，膳食纖維，維生素，礦物質等的生理活性效能[3]。

目前市場上有魚蛋白，魚粉，魚棒和魚肝油。所以發酵魚類等海洋生物下腳料有很大的利用空間和市場價值[4]。同時發酵金槍魚下腳料經過脫腥后經過美拉德反應后可以用于生產金槍魚骨汁飲料[5]。加入一定比例食品配料及食品風味添加劑后可以用于加工生產貓糧等寵物食品[6]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 發酵用乳酸菌及培養基

乳酸菌是由徐州益邦環保科技有限公司提供，該乳酸菌是嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌混合菌，我們又進一步篩選分離，對分離得到的嗜熱鏈球菌及保加利亞乳桿菌分別進行傳代培養保存。培養基為MRS肉湯培養基，主要成分含牛肉浸粉，酵母浸粉，蛋白胨，葡萄糖，磷酸氫二鉀，檸檬酸三銨，乙酸鈉，硫酸錳，硫酸鎂，吐溫。

1.1.2 發酵用酵母菌及培養基

酵母菌是由湖北宜昌安琪酵母有限公司提供，培養基為LB 肉湯培養基，主要成分含酵母浸粉，胰蛋白胨，氯化鈉。

1.1.3 酶解所用酶種類

購于上海瑞永生物科技有限公司，胰蛋白酶(豬胰)比活≥250 U·mg-1，風味蛋白酶比活≥40 U·g-1，中性蛋白酶比活≥50 U·g-1。

1.1.4 原料及試劑

實驗用原料為購舟山水產市場的金槍魚下腳料。

實驗試劑：酒石酸鉀鈉、NaOH、Na2CO3、無水CuSO4等試劑，均為分析純。

1.2 儀器與設備

FA1004 分析天平，上海民橋精密科學儀器有限公司；DGG-9140A 型電熱鼓風恒溫干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；WF-180E 超UV-1600 型紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；HH-2 數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；THZ-8 氣浴恒溫振蕩器，金壇市醫療儀器廠；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；YC-260 L 4 ℃冰箱，LG 電子有限公司；TD5K 離心機，長沙湘智離心機儀器有限公司；SW-CJ-2F 雙人雙面超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；ULUP 超純水機，杭州科曉化工儀器設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酶解工藝

金槍魚下腳料購買后用粉碎機粉碎，在121 ℃下20 min 滅菌，貯存于-20 ℃冰箱中。稱取2.0 g 下腳料，按1：5 的料液比加入無菌水，分別在最適酶解溫度下，按酶活比呈梯度加入胰蛋白酶，風味蛋白酶，中性蛋白酶，酶解后利用福林酚法[7]測定發酵液中可溶性蛋白的含量，并計算出結果。

胰蛋白酶按酶活比6 000，7 000，8 000，9 000，10 000 U·g-1加入，不同添加量下設計3 組平行，留1組空白對照，酶解溫度37 ℃，料液比1：5，金槍魚下腳料用量2 g，酶解時間5 h，考察加酶量對酶解效果的影響。

風味蛋白酶按酶活比6 000，7 000，8 000，9 000，10 000 U·g-1加入，不同添加量下設計3 組平行，留1組空白對照，酶解溫度50 ℃，料液比1：5，金槍魚下腳料用量2 g，酶解時間5 h，考察加酶量對酶解效果的影響。

中性蛋白酶按酶活比6 000，7 000，8 000，9 000，10 000 U·g-1加入，不同添加量下設計3 組平行，留1組空白對照，酶解溫度55 ℃，料液比1：5，金槍魚下腳料用量2 g，酶解時間5 h，考察加酶量對酶解效果的影響。

1.3.2 發酵工藝

稱取2.0 g 下腳料，然后按1：5 的料液比加入無菌水，再接種不同濃度梯度的嗜熱鏈球菌，保加利亞乳桿菌，酵母菌，分天數發酵，利用福林酚法測定發酵液中可溶性蛋白的含量，并計算出結果，逐天記錄。

酵母菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌接種量分別分組10%，20%，30%，40%，50%料液比1：5，發酵溫度為37 ℃，將發酵時間設為1、2、3、4、5、6 d，考察發酵時間對發酵效果的影響。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 可溶性蛋白含量測定

用Folin-酚法[7]進行發酵結果的測定。

標準曲線的制作：取7 支干凈的試管，每管中分別加入標準品溶液0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL。然后補水至0.5 mL，再在每根試管中先用移液槍吸取2.5 mL 福林酚甲試劑，振蕩，于室溫中靜置10 min，然后再用移液槍加入0.25 mL 福林酚乙試劑，振蕩，溶液變成深藍色。室溫靜置1 h 后在酶標儀750 nm 下測定吸光度值，X 軸為牛血清蛋白濃度，Y 軸為吸光度值，繪制標準曲線，吸光度值計算公式為：

1.4.2 可溶性蛋白轉化率測定

用氨基態氮測定法[8]對可溶性蛋白轉化率進行測定。可溶性蛋白轉化率計算公式為：

式中：M 為蛋白轉化率；Y 為發酵前可溶性蛋白含量，mg·mL-1；X 為發酵后可溶性蛋白含量，mg·mL-1；N 為發酵原料總蛋白含量，mg·mL-1。

2 結果與討論

2.1 酶解過程中金槍魚下腳料可溶性蛋白轉化率變化

2.1.1 空白組

2.1.1.1 空白組氨基態氮含量

NaOH 加入量0.88 mL，氨基態氮含量0.061 6 g·mL-1。

2.1.1.2 空白組可溶性蛋白含量

750 nm 下吸光度值0.566，可溶性蛋白含量0.915 mg·mL-1。

2.1.2 胰蛋白酶解組

胰蛋白酶解組氨基態氮含量，蛋白含量，蛋白轉化率平均值及顯著性如表1。

表1 胰蛋白酶解組可溶性蛋白轉化率(mg·mL-1,%)Tab.1 Conversion of soluble protein by trypsin hydrolysis (mg·mL-1,%)

2 g 金槍魚下腳料料液比1：5 時，在37 ℃下隨著胰蛋白酶添加量的增加可溶性蛋白轉化率不斷提高，添加量在接近比活10 000 U·g-1時，可溶性蛋白轉化率趨于穩定。胰蛋白酶添加量越低，顯著性越高。

2.1.3 風味蛋白酶解組

風味蛋白酶解組氨基態氮含量，蛋白含量，蛋白轉化率平均值及顯著性如表2。

表2 風味蛋白酶解組可溶性蛋白轉化率(mg·mL-1,%)Tab.2 The soluble protein conversion rate of savory protease hydrolysis group (mg·mL-1,%)

2 g 金槍魚下腳料料液比1：5 時，在50 ℃酶解溫度下隨著風味蛋白酶添加量的增加可溶性蛋白轉化率不斷提高，添加量在接近比活10 000 U·g-1時，可溶性蛋白轉化率趨于穩定。風味蛋白酶在添加量6 000 U·g-1，7 000 U·g-1時，顯著性相對較高。

2.1.4 中性蛋白酶解組

中性蛋白酶解組氨基態氮含量，蛋白含量，蛋白轉化率平均值及顯著性如表3。

表3 中性蛋白酶解組可溶性蛋白轉化率Tab.3 The soluble protein conversion rate of neutral protease hydrolysis group(%)

2 g 金槍魚下腳料料液比1：5 時，在55 ℃酶解溫度下隨著中性蛋白酶添加量的增加可溶性蛋白轉化率不斷提高，添加量在接近比活10 000 U·g-1時，可溶性蛋白轉化率趨于穩定。中性蛋白酶解組在添加量6 000 U·g-1時，顯著性較高。

2.2 發酵過程中金槍魚下腳料可溶性蛋白轉化率變化

2.2.1 酵母菌發酵組

酵母菌發酵組氨基態氮含量如表4 所示。

表4 酵母菌發酵組氨基態氮含量Tab.4 Amino nitrogen content in yeast fermentation

在酵母菌接種量為10%時，隨著發酵天數的增加，蛋白轉化率不斷提高，發酵4 d 后，顯著性提高，蛋白轉化開始降低(表5)。

表5 酵母菌10%蛋白轉化率(mg·mL-1,%)Tab.5 Protein conversion rate of 10% of yeast(mg·mL-1,%)

酵母菌接種量20%，OD 均值，蛋白含量均值，蛋白轉化率均值，顯著性，結果如表6 所示。在酵母菌接種量為20%時，第1～2 天，蛋白轉化率升高比較明顯，發酵第5 天后，顯著性較高，蛋白轉化率達到最大值，隨后開始降低。

表6 酵母菌20%蛋白轉化率(mg·mL-1,%)Tab.6 Protein conversion rate of 20% of yeast(mg·mL-1,%)

酵母菌接種量30%，OD 均值，蛋白含量均值，蛋白轉化率均值，顯著性，結果如表7 所示。在酵母菌接種量為30%時，第3 至5 天，蛋白轉化率升高比較明顯，發酵第5 天后，顯著性提高，蛋白轉化率達到最大值，隨后開始降低。

表7 酵母菌30%蛋白轉化率(mg·mL-1,%)Tab.7 Protein conversion rate of 30% of yeast(mg·mL-1,%)

酵母菌接種量40%，OD 均值，蛋白含量均值，蛋白轉化率均值，顯著性，結果如表8 所示。在酵母菌接種量為40%時，隨著發酵天數的增加蛋白轉化率逐漸升高，發酵第5 天后，顯著性提高，蛋白轉化率達到最大值，隨后開始降低。

表8 酵母菌40%蛋白轉化率(mg·mL-1,%)Tab.8 Protein conversion rate of 40% of yeast(mg·mL-1,%)

酵母菌接種量50%，OD 均值，蛋白含量均值，蛋白轉化率均值，顯著性，結果如表9 所示。

表9 酵母菌50%蛋白轉化率(mg·mL-1,%)Tab.9 Protein conversion rate of 50% of yeast(mg·mL-1,%)

在酵母菌接種量為50%時，前3 天蛋白轉化率升高比較明顯，第3 天蛋白轉化率達到最大值，顯著性較高，第3 天至第4 天蛋白轉化率降低比較明顯，隨后蛋白轉化率逐漸降低。

2.2.2 保加利亞乳桿菌發酵組

保加利亞乳桿菌發酵組氨基態氮含量如表10 所示。

表10 保加利亞乳桿菌發酵組氨基態氮含量Tab.10 Amino nitrogen content in L.bulgaricus fermentation

保加利亞乳桿菌接種量10%，OD均值，蛋白含量均值，蛋白轉化率均值，顯著性，結果如表11 所示。在保加利亞乳桿菌接種量10%時，隨著天數的增加蛋白轉化率不斷提高，第5 天顯著性提高，蛋白轉化率達到最高，隨后開始降低。

表11 保加利亞乳桿菌10%蛋白轉化率(mg·mL-1,%)Tab.11 10% protein conversion rate of L.bulgaricus(mg·mL-1,%)

保加利亞乳桿菌接種量20%，OD均值，蛋白含量均值，蛋白轉化率均值，顯著性，結果如表12 所示。在保加利亞乳桿菌接種量20%時，隨著天數的增加蛋白轉化率不斷提高，第5 天顯著性提高，蛋白轉化率達到最高，隨后開始降低。

表12 保加利亞乳桿菌20%蛋白轉化率(mg·mL-1,%)Tab.12 20% protein conversion rate of L.bulgaricus(mg·mL-1,%)

保加利亞乳桿菌接種量30%，OD均值，蛋白含量均值，蛋白轉化率均值，顯著性，結果如表13 所示。在保加利亞乳桿菌接種量30%時，隨著天數的增加蛋白轉化率不斷提高，第5 天顯著性提高，蛋白轉化率達到最高，隨后開始降低。

表13 保加利亞乳桿菌30%蛋白轉化率(mg·mL-1,%)Tab.13 30% protein conversion rate of L.bulgaricus(mg·mL-1,%)

保加利亞乳桿菌接種量40%，OD均值，蛋白含量均值，蛋白轉化率均值，顯著性，結果如表14 所示。在保加利亞乳桿菌接種量40%時，第1 至第4 天蛋白轉化率升高速度較快，第4 天蛋白轉化率達到最高，顯著性較為明顯，隨后開始降低。

保加利亞乳桿菌接種量50%，OD均值，蛋白含量均值，蛋白轉化率均值，顯著性，結果如表15 所示。在保加利亞乳桿菌接種量50%時，第1 至第3 天蛋白轉化率升高速度較快，第3 天顯著性提高，蛋白轉化率達到最高，之后開始降低。

表15 保加利亞乳桿菌50%蛋白轉化率(mg·mL-1,%)Tab.15 50% protein conversion rate of L.bulgaricus(mg·mL-1,%)

2.2.3 嗜熱鏈球菌發酵組

嗜熱鏈球菌發酵組氨基態氮含量如表16 所示。

表16 嗜熱鏈球菌發酵組氨基態氮含量Tab.16 Amino nitrogen content of S.thermophilus fermentation

嗜熱鏈球菌接種量10%，OD均值，蛋白含量均值，蛋白轉化率均值，顯著性，結果如表17 所示。在嗜熱鏈球菌接種量10%時，第1 至第5 天蛋白轉化率逐漸升高，第5 天顯著性提高蛋白轉化率達到最高，之后開始降低。

表17 嗜熱鏈球菌10%蛋白轉化率(mg·mL-1,%)Tab.17 10% protein conversion rate of S.thermophilus (mg·mL-1,%)

嗜熱鏈球菌接種量20%，OD均值，蛋白含量均值，蛋白轉化率均值，顯著性，結果如表18 所示。在嗜熱鏈球菌接種量20%時，第2 天至第3 天蛋白轉化率升高較快，第5 天顯著性提高蛋白轉化率達到最高，之后開始降低。

表18 嗜熱鏈球菌20%蛋白轉化率(mg·mL-1,%)Tab.18 20% protein conversion rate of S.thermophilus (mg·mL-1,%)

嗜熱鏈球菌接種量30%，OD均值，蛋白含量均值，蛋白轉化率均值，顯著性，結果如表19 所示。在嗜熱鏈球菌接種量30%時，接種后從第1 天開始蛋白轉化率逐漸升高，第5 天顯著性提高蛋白轉化率達到最高，之后開始降低。

表19 嗜熱鏈球菌30%蛋白轉化率(mg·mL-1,%)Tab.19 30% protein conversion rate of S.thermophilus (mg·mL-1,%)

嗜熱鏈球菌接種量40%，OD均值，蛋白含量均值，蛋白轉化率均值，顯著性，結果如表20 所示。在嗜熱鏈球菌接種量40%時，接種后從第1 天至第3 天蛋白轉化率升高較快，第3 天顯著性較高，蛋白轉化率達到最高，隨后開始降低。

表20 嗜熱鏈球菌40%蛋白轉化率(mg·mL-1,%)Tab.20 40% protein conversion rate of S.thermophilus(mg·mL-1,%)

嗜熱鏈球菌接種量50%，OD均值，蛋白含量均值，蛋白轉化率均值，顯著性，結果如表21 所示。在嗜熱鏈球菌接種量50%時，接種后從第1 天至第3 天蛋白轉化率升高較快，第3 天顯著性提高蛋白轉化率達到最高，隨后蛋白轉化率開始降低。

表21 嗜熱鏈球菌50%蛋白轉化率(mg·mL-1,%)Tab.21 50% protein conversion rate of S.thermophilus(mg·mL-1,%)

2.3 討論

金槍魚下腳料在酶解過程中，在蛋白酶的作用下會酶解成氨基酸小分子肽等物質[9]，導致可溶性蛋白轉化率提高，隨著蛋白酶添加量的提高，蛋白轉化率逐漸提高，蛋白酶添加量超過8 000 U·g-1后，轉化率升高速度趨于平穩，分析可能達到酶解過程中蛋白酶轉化率的最大值。風味蛋白酶轉化率最大值16.79%，胰蛋白酶轉化率最大值16.63%，中性蛋白酶轉化率最大值16.57%。風味蛋白酶酶解效果優于胰蛋白酶優于中性蛋白酶。王雨生等[10]為了從金槍魚皮制備膠原蛋白肽，從木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶中篩選出金槍魚皮酶解的最佳蛋白是風味蛋白酶。

在接種菌發酵過程中，初始階段隨著發酵天數的增加可溶蛋白轉化率逐漸提高，后隨著發酵過程的進行，發酵用底料到達菌落總數最大值，部分菌落開始死亡，可溶蛋白轉化率開始降低。發酵過程可溶蛋白轉化率隨著接種量的提高，有個先升高再降低的過程，分析加菌量過多，可能導致菌落更早到達菌落總數最大值。章新[11]乳酸菌與酵母菌發酵作用不同程度上都對魚有脫腥作用，與對照組比較，其魚腥味明顯降低，表現出來的脫腥風味可能與其發酵產生的產物不同引起的。

棘懷飛等[12]發現美拉德反應對金槍魚紅肉酶解液的揮發性物質和游離氨基酸的組成及含量均有不同程度的影響。后續實驗可以以可溶性蛋白轉化率為指標檢測美拉德反應對蛋白含量的影響，通過美拉德反應釋放的特殊氣味探索酶解發酵脫腥工藝。

3 結論

通過對實驗數據進行分析在金槍魚下腳料添加量為2 g，料液比1：5 時，酶解過程風味蛋白酶轉化率最大值16.79%，胰蛋白酶轉化率最大值16.63%，中性蛋白酶轉化率最大值16.57%。發酵過程中，酵母菌接種量40%在發酵第5 天時，蛋白轉化率出現最大值為16.48%，酵母菌隨著接種量的升高，蛋白轉化率也隨之升高，接種量超過40%后，蛋白轉化率升高不再明顯。保加利亞乳桿菌接種量30%在發酵第5 天時，蛋白轉化率出現最大值16.98%，保加利亞乳桿菌接種量30%，蛋白轉化率升高比較明顯，發酵效果比較好，后隨著接種量的提高，蛋白轉化率開始降低。嗜熱鏈球菌接種量30%在發酵第5 天時，蛋白轉化率出現最大值15.77%，嗜熱鏈球菌隨著接種量的提高，蛋白轉化率開始提高，在接種量30%時，蛋白轉化率比較好，之后隨著接種量的提高轉化率開始降低。酵母菌類最適接種量40%，乳酸菌類最適接種量30%。

酶解及發酵過程，分別能使蛋白轉化率提高，提高金槍魚下腳料等低值海產品加工副產物的利用率[13]，在不同加酶量及接種量條件，不同接種時間下可溶蛋白轉化率發生變化。后續可以通過菌酶聯合實驗，找到進一步提高可溶蛋白轉化率的方式。同時酶解發酵產生的小分子肽具有豐富的營養價值，又有防病抗病等多種功能[14]。肽制劑可能成為繼維生素、氨基酸之后在飼料中又一種必不可少的添加物。通過相關實驗去除金槍魚下腳料等低值海洋產品加工副產物的腥味，發酵金槍魚汁飲料及寵物食品很有潛力和價值。